抑制自噬增強TRAIL誘導前列腺癌細胞凋亡的實驗研究

王文軒，何衛陽，茍 欣

(重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，重慶 400016)

我國的前列腺癌的發病率在逐年升高，多數病例發現時已處于晚期，失去手術時機[1-2]。去勢與抗雄激素治療雖然效果較好，但一般在18～24個月后轉化為激素非依賴性前列腺癌，此時，治療非常棘手。化療作為一項重要手段，在激素非依賴性前列腺癌中的治療地位越來越受到重視。但原發性或獲得性藥物抵抗明顯降低了化療藥物的效果。研究表明腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)可以有效的誘導腫瘤細胞凋亡，且不良反應很小，是一個極具前景的腫瘤治療藥物[3-4]。然而，TRAIL耐藥卻限制了它的治療效果，而且其機制仍不明確。TRAIL與它的功能受體DR4及DR5結合后通過外源性凋亡通路促進腫瘤細胞凋亡，TRAIL與受體結合后促進死亡復合體的形成，死亡復合體包括Fas相關死亡域蛋白(FADD)、凋亡蛋白酶8(Caspase8)以及c-FLIP。Caspase8通過自我活化，促進死亡受體下游效應蛋白Caspase7和Caspase3的激活，從而誘導凋亡。

自噬(autophagy)是細胞進化的保守信號通路，通過降解長命蛋白及受損細胞器實現能量的再循環利用，維持細胞的能量平衡。自噬對于維持細胞在缺乏營養狀態下的生存以及清除細胞受損的細胞器和多余的蛋白至關重要[5-6]。

目前文獻報道，放、化療可以誘導自噬，但放、化療誘導的自噬在不同的制劑以及不同的細胞系其作用可能不同，或起促生存或起促死亡作用[7]。雖然有文獻報道TRAIL處理結腸癌可以誘導細胞發生自噬，而且抑制自噬可以增強腫瘤細胞TRAIL的敏感性[8]；但TRAIL對于前列腺癌細胞是否可以誘導自噬以及自噬的作用如何，還尚不清楚。本文擬研究TRAIL對前列腺癌細胞自噬水平的影響，以及自噬在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 改良型RPMI1640培養液購自Hyclone公司,0.25%胰蛋白酶加乙二胺四乙酸(EDTA)購自Gibco公司，DMSO 購自吉諾生物醫藥技術有限公司，Anti LC-3B購自Sigma公司；An-ti P62、Caspase8、PARP購自B&D公司。LDH試劑盒購自Promega公司。TRAIL由本實驗室提取制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞株及培養條件 雄激素非依賴性人前列腺癌細胞株PC-3購自ATCC，培養在 RPMI 1640 加上10% 胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素培養基中。

1.2.2 細胞毒性測定 在96孔板內測定應用乳酸脫氫酶釋放試驗(LDH)進行前列腺癌細胞細胞毒性測定。細胞種植在48孔板內過夜，細胞生長到70%～80%時按圖1中標注處理36 h后進行LDH檢測。

1.2.3 免疫印跡檢測 細胞蛋白質免疫印跡(Western blotting)檢測各種細胞用M2 提取總蛋白，取同等量蛋白上樣以5%的濃縮膠、12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，電轉蛋白至PVDF膜，5% BSA 37 ℃封閉1 h，與一抗4℃孵育過夜，PBS洗膜3次后與辣根過氧化物酶標記的1∶2 000二抗室溫孵育1 h。PBS沖洗3次，每次約5 min，然后加顯色劑，暗室曝光并洗片。

2 結 果

2.1 TRAIL可以誘導自噬 PC-3經TRAIL處理后可以明顯增加LC-3BⅠ向LC-3BⅡ的轉化；同時可以明顯增加P62的降解；這兩個蛋白的變化是自噬的主要標志；另外，為了進一步證明這些蛋白的變化是自噬活性增強誘導的，用“自噬潮”實驗檢測，即是應用抑制自噬體和溶酶體的融合的氯喹(chloroquine,CQ)及TRAIL分別處理PC-3，以及聯合二者處理PC-3，結果示：CQ和TRAIL可以適當增加LC-3BⅡ的表達，而二者聯合可進一步增加LC-3BⅡ的表達。這些結果可以肯定TRAIL可以誘導自噬。見圖1。

A:TRAIL(150 ng/mL)在不同時間點處理PC-3，然后應用Western blotting檢測LC-3B及p62的表達；B:TRAIL(150 ng/mL)和CQ(20 μM)分別或聯合處理PC-3 2 h，然后應用Western blotting檢測LC-3B的表達。

圖1 PC-3細胞LC-3B及p62表達檢測

2.2 TRAIL誘導的自噬對前列腺癌細胞起保護作用 PC-3經TRAIL單獨處理或TRAIL加不同類型的自噬抑制劑，LDH檢測發現，應用不同類型的抑制劑可以明顯增加TRAIL的細胞毒性。應用Western blotting檢測發現，抑制自噬可以明顯增加TRAIL誘導的凋亡蛋白Caspase 8 的活化和PARP的裂解(圖2)。

A：PC-3細胞種植于48孔板培養24 h，然后提前半小時加入自噬抑制劑Wortmannin (WMT，1 μM)、CQ(20 μM)，再分別加入TRAIL(150 ng/mL)36 h，應用LDH檢測細胞的死亡率；B:TRAIL(150 ng/mL)單獨和TRAIL(150 ng/mL) 聯合CQ(20 μM)處理PC-3 4 h，然后應用Western blotting檢測Caspase 8及PARP的表達。

圖2 自噬對PC-3細胞活性影響及Caspase 8和PARP的表達檢測

3 討 論

自噬是一種普遍存在的真核細胞特有的生命現象，在維持細胞自我穩態、促進細胞生存方面起重要作用。研究證明：自噬與衰老、神經疾病、腫瘤等密切相關。目前自噬已成為腫瘤領域的研究熱點。研究自噬發生的方法較多，但LC-3Bc表達的增強及P62蛋白的降解目前仍是自噬的主要標志物[9]。如圖1A所示，TRAIL可以明顯增加LC-3BⅡ表達及P62的降解。然而，LC-3BⅡ表達的增強不能完全除外自噬后期的抑制所致，所以“自噬潮”可以進一步確定TRAIL是否可以誘導自噬。如圖1 B所示，溶酶體抑制劑氯喹和TRAIL單獨可以增加LC-3BⅡ的表達，當聯合應用CQ以及TRAIL后則進一步增加LC-3BⅡ的表達。本研究結果表明，TRAIL可以顯著誘導前列腺癌細胞的自噬。

研究表明，自噬主要是促生存作用，但在一定條件下，可以促進細胞死亡，所以自噬的作用具有細胞特異性、刺激因子特異性以及環境特異性等特點。故自噬在不同刺激下，在不同的細胞系可能會起不同的作用。自噬在腫瘤的發生、發展甚至轉移等方面都具有重要作用，調控自噬目前成為腫瘤治療的重要手段[10]。雖然文獻報道，TRAIL可以誘導敲除Bax的結腸癌細胞Hct116產生自噬，并且抑制自噬可以增加結腸癌細胞的凋亡，然而TRAIL對于前列腺癌PC-3細胞的作用以及可能產生的自噬作用目前仍不清楚。本研究顯示，TRAIL可以誘導前列腺癌PC-3細胞產生自噬，而且自噬起保護腫瘤細胞作用，Wortmannin及氯喹抑制自噬均可以顯著增加PC-3細胞的死亡率(P<0.05)、凋亡蛋白Caspase8的活化以及PARP的裂解。這與多數惡性腫瘤的研究結果相符。

本研究的結果表明TRAIL可以誘導前列腺癌細胞產生保護性自噬，而抑制自噬可以顯著增強TRAIL誘導的前列腺癌細胞凋亡，這對于逆轉耐藥前列腺癌細胞尤為重要。然而TRAIL誘導自噬的機制目前仍不明確，究竟是通過JNK激活Bcl-xl磷酸化，Beclin復合物解體Beclin1釋放通路還是其他信號通路[11-12]，還需要后續的進一步研究。

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