蜂膠與檸檬提取物混合液對變形鏈球菌作用的體外研究

楊清嶺，連 爽，趙 王月，李寶花，莫文靜

(佳木斯大學附屬第二醫院兒童牙病科，黑龍江 佳木斯 154002)

齲病是人類最常見的口腔疾病，其中與齲病密切相關的變形鏈球菌是口腔中最常檢出的致齲菌，它能發酵出多種碳水化合物產生乳酸，其產酸力、速度、耐酸性均強于其他口腔鏈球菌，可在pH低至4.2的環境中生存。它的致齲因素主要在于對牙面的黏附、聚集、產酸以及耐酸，乳酸脫氫酶將細菌代謝的中間產物丙酮酸還原成乳酸，造成牙面的酸性環境，而這些是齲病發生的首要條件，因此本實驗重點研究混合液對變形鏈球菌生長、產酸的作用，且進一步探討混合液對變形鏈球菌代謝產酸的機制。近年來，天然提取物因來源豐富、取材方便、療效好、副作用輕微而引起人們的關注。鑒于蜂膠是一種天然的生物材料，具有廣泛的藥理作用，抑菌效果好、毒副作用小，但有一定的苦澀感；檸檬提取物有很強的生物學活性，其主要成分具有較強的抗炎活性，能抑制細菌、真菌、病毒的生長繁殖，沒有毒副作用，而且口感芳香。本實驗研究探討將這兩種天然物質聯合應用于防齲，為兩者混合液防齲的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蜂膠(水溶性，純度98%)，檸檬提取物(精細粉末，100%通過80目)(購于西安森卓生物科技有限公司)；變形鏈球菌(菌株編號為ATCC25175，由四川大學華西口腔醫學院提供)；BHI瓊脂培養基，BHI液體培養基(購于杭州天和微生物試劑有限公司)；漱爽復方氯已定含漱液(哈爾濱樂泰藥液有限公司)；噻唑藍MTT(上海金穗生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.2 變形鏈球菌菌懸液制備

將凍干保存的菌種S.m于液體BHI培養基中復蘇，37℃厭氧培養24h，經革蘭染色鏡檢為純培養后，用比濁儀調整菌懸液濃度至0.5 McFarland(108CFU/mL) 。

1.3 實驗藥液的制備

將固體水溶性蜂膠溶解于無菌液體BHI中，攪拌使其充分溶解，濾去未溶解部分蜂膠，經計算配置成100mg/mL蜂膠母液，用BHI液體培養基將蜂膠稀釋成以下濃度0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL；同理制備100mg/mL檸檬提取物母液，用BHI液體培養基將檸檬稀釋成以下濃度：12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL。

1.4 混合液對變形鏈球菌生長的影響

1.4.1 確定蜂膠、檸檬單組份的MIC值

用MTT法測蜂膠、檸檬各濃度組OD值，并計算抑菌率，當抑菌率達到80%時的最小濃度即為其MIC值。本實驗設陽性對照組(氯已定加菌液)、陰性對照組(液體培養基加菌液)、空白對照組(液體培養基)。抑菌率=(陰性對照OD值-實驗OD值)/(陰性對照OD值-空白對照OD值)×100(%)。

1.4.2 確定混合液的MIC值

MTT法測蜂膠、檸檬各濃度組混合液的OD值，在96孔板上每一橫排分別加入0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL蜂膠溶液100μL，縱排加入12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL檸檬提取物溶液100μL，此時蜂膠濃度為0.39、0.25、0.2、0.1、0.05mg/mL，檸檬提取物溶液濃度為6.25、5、3.13、1.56、0.78mg/mL。兩溶液充分混勻后，每孔分別加入準備好的菌液20μL，并設置陽性對照、陰性對照、空白對照。于37℃(90%N2,10%CO2)厭氧培養24h，用酶標儀測量OD值并計算，當抑菌率達到80%時的最小濃度為其MIC值，實驗重復3次。

1.4.3 聯合用藥效果評價

根據單獨用藥和聯合用藥的抑菌效果，計算分級抑制濃度(FIC)指數，從而檢測兩者的抗菌作用關系。FIC=蜂膠聯合時MIC/蜂膠單獨時MIC+檸檬聯合時MIC/檸檬單獨時MIC。當FIC≤0.5時為協同作用，0.52時為拮抗作用。

1.5 蜂膠-LPE對S.m產酸能力的影響

利用二倍稀釋法配置如下四個濃度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(設空白對照組)，按菌液與藥物混合液1：10(v/v)比例接種S.m，37℃厭氧培養24h，離心(1500r/min,20min)取上清液，用pH計測定pH，重復測定3次，取平均值，計算pH的變化：△pH=初始pH(7.4)-終末pH。

1.6 蜂膠-LPE對S.m乳酸脫氫酶活性的影響

利用二倍稀釋法配置如下四個濃度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(設空白對照組)，按菌液與藥物混合液1：10(v/v)比例接種S.m，37℃厭氧培養24h，離心(3300r/min,20min)，取上清液備用。每管中的上清液利用二硝基苯肼法測乳酸脫氫酶活性。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 變形鏈球菌分別在不同濃度蜂膠溶液和LPE中的生長情況見表1、2。

蜂膠溶液和LPE抑菌率在80%以上的最小濃度分別為0.39mg/mL和6.25mg/mL。根據實驗結果判定蜂膠MIC值為0.39mg/mL，LPE的MIC值為6.25mg/mL。

表1 不同濃度蜂膠溶液對S.m的抑制情況

注：各實驗組與陰性對照組比較有統計學意義(P<0.05)

表2 不同濃度LPE對S.m的抑制情況

注：各實驗組與陰性對照組比較有統計學意義(P<0.05)。

2.2 變形鏈球菌在不同濃度蜂膠溶液和 LPE混合液中的抑制情況

由表3可以計算出抑菌率：蜂膠0.2mg/mL，LPE5mg/mL時為82.72%，蜂膠0.25mg/mL，LPE1.56mg/mL時為84.28%，均可以達到抑制S.m的MIC值。蜂膠與LPE聯用時，其MIC值為0.2mg/mL，LPE與蜂膠聯用時，其MIC值為1.56mg/mL，根據公式計算得FIC=0.75。表明蜂膠與LPE聯用時為相加作用。

表3 蜂膠-LPE混合液抑制S.m OD值

2.3 混合液對S.m產酸能力及乳酸脫氫酶活性的影響

選用蜂膠0.2mg/mL，LPE5mg/mL作為兩者聯合應用時的MIC值，以二倍稀釋法配制低于此MIC的4個濃度梯度混合液，其對S.m產酸能力及抑制LDH活性，見表4。結果顯示：S.m的產酸能力及抑制LDH活性隨混合液濃度的增加而明顯降低。各濃度組與陰性對照組均有統計學差異(P<0.05)。

表4 蜂膠-LPE混合液對S.m產酸的影響

注：各實驗組與空白對照組比較有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

研究表明變形鏈球菌是主要的致齲菌。耐酸性是變形鏈球菌致齲的重要毒力之一，進食碳水化合物后，口內菌斑變化范圍很廣，Stephen曲線表明，菌斑pH可以在20min內從7.0迅速下降至3.0～4.0。在胞外pH為4.0時，變形鏈球菌仍有質子流動和合成ATP，糖酵解繼續進行，這保證了變形鏈球菌的高耐酸性，且在低pH下耐酸性反而增強，這使得變形鏈球菌在低pH環境下更具致齲性和生存優勢。利用碳水化合物發酵產酸產生乳酸是致齲菌的重要特征，抑制變形鏈球菌乳酸脫氫酶活性，減少細菌產乳酸量，改變牙菌斑的酸性環境，是控制齲病發生的途徑之一。許多學者已進行過不少防治齲病的藥物研究，發現抗生素類、氯已定及其相關化合物對齲病有較好的防治作用，但是抗生素毒副作用過大及細菌產生耐藥性的問題因而最終難以在齲病預防中推廣。變鏈菌有抑制作用。然而，使用單味藥抗菌，其單純的抑菌或殺菌作用，可能對口腔因而本實驗研究將蜂膠與檸檬提取物聯合應用于防齲，探討這兩種物質的混合液的抗菌機制，為臨床應用提供實驗依據。

蜂膠抗菌有效成分為黃酮類化合物、松屬素、高良姜素等，蜂膠的抗菌作用原理十分復雜，Popova等研究發現: 黃酮類成分能夠分解細菌胞膜的能量，限制細菌的運動；Marcucci MC等發現:蜂膠對不同細菌和霉菌不但具有直接抑制作用，而且能夠抑制細菌對細胞的黏附。檸檬提取物是從水果皮中提取出來的,有50多種有效成分,橘皮含有橙皮素、橙皮苷、橘櫞酸及還原糖、揮發油、α-蒎烯、β-水芹烯。研究報告指出,檸檬提取物的主要成分為橘皮苷和橙皮素都能被腸胃吸，且表明檸檬提取物具有良好的生物安全性，能有效抑制口腔主要致齲菌的生長，是具有潛力的防齲藥物。本實驗通過測量兩種藥物單獨作用時的MIC值，和聯合應用時的MIC值，經過計算和對比，兩提取物聯合應用防齲，達到了降低單組分的使用劑量和毒副作用。

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