奧拉西坦/丁基苯酞對新生大鼠缺氧缺血性腦病的相關研究

穆國軍，李曉迪，顧鏡月，李惠玲，張偉東，郭海濤

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內一科，黑龍江 佳木斯 154003)

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)，是指由乏氧引起大腦水腫、軟化和壞死等一種病變，是新生兒期致殘的主要病因[1～3]。而如何改善大腦微循環障礙及腦部水腫狀態，保護大腦神經組織，控制驚厥，是防治本病的重要環節[4～6]。本實驗首先通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，聯合應用神經保護劑—ORS及改善腦微循環障礙藥物—NBP，并通過檢測不同時間點各組動物大腦組織含水量、超氧化物歧化酶(SOD)含量及水通道蛋白-4(AQP-4)和環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)表達情況證實藥物的可靠疊加性效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar新生大鼠100只，雌雄不限，出生后7d(相當于人類新生兒期)。佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

SOD試劑盒(上海生工生物科技公司)，ORS，NBP，AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠多克隆抗體及二抗(Sigma 美國)。

1.3 制備動物模型

經乙醚麻醉后，取頸部正中切口，分離結扎左側頸總動脈，放入含有8%氮氣和2%氧氣的密閉容器持續2h，制備成HIE模型。將出現左旋或夾尾左旋者納入試驗。

1.4 實驗分組及給藥

出生7d大鼠共分為4組，每組25只。正常組:分離左側頸總動脈后在動脈下置線, 不結扎亦不低氧。模型組:制備大鼠HIE模型立即腹腔注射生理鹽水0.1mL/只。對照組: 模型后立即腹腔注射ORS 100mg/kg，即12h，1d，3d，7d在HIE后即刻給藥一次；實驗組: 模型完成后立即腹腔注射ORS 100mg/kg，30min后腹腔注射丁基苯酞 10mg/kg，給藥次數同對照組。

1.5 樣品處理

按照不同時間點處死各組動物，大鼠經拉頸處死后迅速于冰上開顱分離腦組織，按不同檢測目的分別儲存大腦及部分腦干脊髓組織。

2 方法

2.1 腦組織含水量的測定

采用干濕質量法測定腦組織含水量。取各組等量腦組織濾紙吸干表面水分后電子天平稱量濕重，再將組織置于80℃烘箱烤干測恒重，按Ellis公式，腦含水量=〔(濕重-干重)/濕重〕×100%計算含水量。

2.2 SOD活性測定

按SOD測定試劑盒說明檢測大腦組織總超氧化物歧化酶活力(測吸光度值，從而計算勻漿組織的總SOD活力)。

2.3 免疫組化

取左腦組織，常規組織樣品包埋及組織切片制備進行免疫組化檢測。首先對組織載玻片進行脫蠟與復水處理。再將其入3%H2O2液中浸泡15min，經蒸餾水沖洗3min×1次，0.01M PBS液沖洗2min×3次，經抗原修復后，加入AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠多克隆抗體，每張切片50μL。4℃冰箱過夜。0.01M PBS液沖洗2min×3次后滴加生物素化二抗每張切片50μL，濕盒37℃過夜后0.01M PBS液沖洗2min×3次，滴加S-A/HRP室溫孵育15min。0.01M PBS液沖洗2min×3次后DAB顯色。經復染、脫水透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察陽性細胞表達。

2.4 western blot檢測

對各組樣品進行組織總蛋白提取并定量。分別取等量總蛋白(25μg/孔)加上樣緩沖液于沸水中煮5 min，以10%SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后將凝膠上的蛋白經濕轉膜儀轉至PVDF膜上，用含5%小牛血清白蛋白BSA的TBST溶液封閉2h，分別加入AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠抗體，4℃孵育過夜，HRP標記的二抗室溫孵育2h，ECL化學發光，X線顯影，掃描。以GAPDH蛋白水平作為內參對照，實驗重復3次。

2.5 統計學處理

采用SPSS13.0統計分析軟件進行分析， 所得所有數據以均數±標準差表示，單因素方差分析進行兩兩比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 腦組織含水量

本實驗采用濕重法檢測腦組織含水量進以表示腦水腫程度。結果顯示模型組12h即可出現腦水腫，而后呈上升趨勢，3d后達到高峰，之后有下降，各時間點與空白組比較有差異性(P<0.05)。較模型組，實驗組及對照組含水量明顯下降，且實驗組下降量高于對照組，同一時間點兩兩比較差異性有顯著意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組動物各時間點腦組織含水量測定

與空白組同時間點比較，差異具有統計學顯著意義(P<0.05)。

3.2 腦組織SOD含量測定

顯示模型組12h即可出現SOD下降趨勢，而后持續下降，3d后達到高峰，各時間點與空白組比較有差異性(P<0.05)。較模型組，實驗組及對照組SOD含量明顯上升，且實驗組高于對照組，同一時間點兩兩比較差異性有顯著意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組動物各時間點腦組織SOD含量測定

與空白組同時間點比較，差異具有統計學顯著意義(P<0.05)。

3.3 免疫組化染色

3d時，空白組可見AQP-4呈弱陽性表達，各時間點無明顯變化(圖1A)。模型組各時間點與空白組比較染色較深，數量多(圖1B)，但各時間點免疫陽性細胞灰度值較空白組低，差異有統計意義(P<0.05)。與模型組比，實驗組及對照組各時間點AQP-4灰度值均相對較低(圖1C-1D)，且實驗組低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。CREB蛋白在空白組3d時呈高表達，模型組較空白組比較染色淺，數量少。與模型組比，實驗組及對照組各時間點CREB蛋白灰度值均相對較高(圖1C-1D)，且實驗組高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3.4 western blot檢測

蛋白印跡顯示說明模型組較空白組AQP-4蛋白表達水平明顯上升，CREB蛋白蛋白表達明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)；實驗組較模型組CREB蛋白表達水平明顯升高，AQP-4蛋白表達下降，差異有顯著意義(P<0.05)；對照組AQP-4較模型組有下降，但高于實驗組，實驗組AQP-4蛋白表達高于對照組但接近空白組，差異具有顯著性(P<0.05)，見圖2。

圖1 3d時實驗組免疫組化染色

圖2 各組AQP-4及CREB蛋白在3d時蛋白表達情況

4 討論

新生兒缺氧缺血性腦病以其高發病率及高致殘率成為威脅人類健康的重要病變。它的發病因素主要指由圍生期呼吸驟停及嚴重肺部感染所致的缺氧及嚴重系統疾病所致的缺血，發病機制涉及到血流動力學變化、腦細胞能量代謝衰竭、再灌注損傷及神經損傷。HIE發病機制復雜，是各種機制綜合一起的連鎖反應，大量研究證實多數神經元不是死于缺氧缺血時，而是死于缺血缺氧后數小時至數天，這種遲發型的細胞死亡是可以通過發病后的干預來預防及減輕病癥的。

目前關于HIE的藥物及方法主要集中在改善腦水腫和微循環障礙、消除自由基和保護大腦神經組織等方面。本實驗首先進行了HIE模型的制備，然后選用神經保護劑藥物ORS及改善腦微循環障礙藥物—NBP，在試驗中的聯合運用中增加疊加效應，對大鼠的早期HIE的治療起到了改善作用。通過對本實驗中對大鼠分組用藥后不同時間點的檢測，可以發現與模型組比較，實驗組的大腦含水量低于對照組，說明所選藥物在改善腦水腫方面有比較好的改善作用。通過SOD活性含量的檢測，也可以發現在本實驗中實驗組的SOD活性明顯增加高于對照組，說明藥物的聯合運用在改善腦神經活性方面也有優勢作用。目前國內外研究證實，AQP-4與腦水腫的形成有關系，本實驗的研究中發現，模型組在缺氧缺血下AQP-4上調了其表達，在第3天達到高峰，這與腦組織水腫的發生與發展時間上基本一致，說明了AQP-4在腦水腫中有重要作用。國外有研究表明，AQP-4的表達的抑制，可避免神經膠質細胞過度腫脹，神經膠質細胞腫脹是由于再氧后水外排速度減慢所致，所以AQP-4對于缺氧缺血性腦病有雙向的水介導的跨膜轉運。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白是腦缺血神經元存活心肌缺血或谷氨酸預處理后的一個重要媒介，谷氨酸NMDA受體門控鈣離子內流和后續的CaMⅡ—Ⅳ的活化誘導CREB的磷酸化，細胞應激(例如缺血等)時磷酸化的CREB(phosphorylation of c-AMP response element binding protein，p-CREB)提供了神經保護性作用，因而重新評價興奮性氨基酸拮抗劑的保護作用具有重要意義。本試驗通過免疫組化及western blot檢測發現AQP-4在HIE后12h表達既有升高，1d明顯增強，3d后達高峰，與腦含水量變化一致，再次證實了AQP-4參與了HIE后腦水腫的形成，通過本實驗藥物的運用過程中發現，與模型組比較，實驗組與對照組同時間點下AQP-4呈低表達，且實驗組低于對照組，說明了藥物在抑制早期HIE發病過程中具有明顯意義，而CREB在實驗組中的表達較模型組也比較明顯，接近空白組，并結合這兩種藥物的保護神經組織作用及改善微循環的意義，說明了兩種藥物的疊加效應是有意義的。

通過本實驗的研究證明，藥物在HIE的治療過程中顯示了強大應用前景，在本實驗HIE的治療過程中，藥物的作用可以下調AQP-4表達，減輕腦水腫，也初步顯示了神經保護作用，為下一步研究工作奠定了基礎，但是實驗研究與臨床應用存在一定差異，且由于時間關系本實驗的應用劑量及周期未作進一步研究，希望在以后的研究中可以得到進一步深化。

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