乳腺癌CYP1B1基因多態性與ER、PR表達的關系

國玉芝，曲秀梅，太史婧華，方 芳，張志國

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

細胞色素P4501B1 (cytochrome P450 1B1,CYP1B1)是細胞色素P450超基因家族成員之一，被認為其基因在癌癥特異性高表達[1]及由于其影響雌激素受體(estrogen receptor，ER)和孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達而成為多種女性癌癥(乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌)的致病基因[2～4]，但是不同研究者得出的結論不盡相同。本文力圖通過檢測乳腺癌手術患者血液CYP1B1 SNP rs1056827、rs1056836基因多態性與病理組織ERα、PR表達的關系及病理組織與癌旁組織CYP1B1表達與乳腺癌的關系，從而為臨床診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2010～2013年末乳腺癌手術患者作為研究對象，手術前采集患者血樣留作檢測CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多態性樣本，手術時留存病理及癌旁組織石蠟包埋組織塊作為檢測CYP1B1、ERα、PR表達樣本。

儀器:S1000 Thermal Cycler PCR儀、PowerPac Universal 通用型電泳儀、ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；H2500R-2高速冷凍離心機(上海滬譽貿易有限公司)。

試劑:Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit、Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)、GeneRuler 100 bp DNA Ladder、Thermo Scientific FastDigest Eam1105 I、Thermo Scientific FastDigest AleI 內切酶，以上試劑為Fermentas公司生產。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司北京測序部完成。SP試劑盒、ERa鼠抗人單克隆抗體、PR鼠抗人單克隆抗體、兔抗人CYP1B1多克隆抗體，購自上?？撇噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因檢測

CYP1B1 SNP rs1056827 PCR引物：F 5＇...CTCGTT-CGCTCGCCTGGCGC ...3＇R 5＇...GAAGTTGCGCATC-ATGCTGT...3＇;CYP1B1 SNP rs1056836 PCR引物：F 5＇...ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT...3＇R 5＇...TATGGAGCACACCTCACCTG...3＇；擴增體系：Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)12.5μL，F、R primer各1μL，血液DNA 1μL，ddH2O 9.5μL；PCR條件：預變性95℃4min、變性95℃30s、退火56℃30s，延伸72℃30s，72℃末延伸5min；共35個循環；酶切體系及條件：10X FastDigest Green Buffer 2μL，FastDigest enzyme 1μL(rs1056827使用Eam1105I，rs1056836使用AleI)，ddH2O 17μL，PCR 產物10μL；水浴37℃酶切10min，然后取出立即置水浴65℃滅活5min。電泳：使用2%瓊脂糖凝膠，電壓145V，電泳45min。觀察結果及拍照：電泳結束，把凝膠從膠板上取出，放到凝膠成像系統中按凝膠成像儀中觀察結果并拍照。

1.2.2 ERa, PR免疫組化檢測

(1)切片：乳腺癌病理標本同時制成約5μm厚切片，(2)脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，每次10min；(3)洗滌切片：經下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次(每次2min)，85%乙醇2min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O洗2次，每次2min；(4)抗原修復：浸入枸椽酸鈉緩沖液中微波爐抗原修復20min，自然冷卻，滴加1：200稀釋的兔抗人CYP1B1抗體(一抗)，完全覆蓋組織，4℃過夜。加山羊血清封閉10min,傾去封閉液，滴加二抗工作液，37℃水浴床孵育30min。滴加高敏過氧化物酶，37℃水浴床孵育30min。滴加新鮮配制的DAB溶液，顯色10min，自來水沖洗，蘇木素輕度復染1min，鹽酸乙醇分化，淡氨水返藍，脫水，中性樹膠封固。每次染色均以已知陽性的乳腺癌切片作為CYP1B1陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 統計學分析

基因型分布和等位基因頻率經χ2檢驗計算器v1.61進行χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 CYP1B1 擴增產物酶切后電泳

A rs1056827，L 100bp DNA Ladder ;2、5 G/G野生型純合子，1、3 G/T雜合子，4、6 T/T突變型純合子； B rs1056836, L 100bpDNA Ladder ;1、3、6、C/C野生型純合子，2、5 C/G雜合子，4 G/G突變型純合子。

2 結果

2.1 基因型分析

CYP1B1 SNP rs1056827擴增產物為250bp。野生型純合子 G/G為250bp一條帶；雜合子G/T為114、136、250bp三條帶；突變型純合子T/T為：114、136bp兩條帶。CYP1B1 SNP rs1056836 PCR擴增產物623bp，野生型純合子C/C為491、132bp兩條帶；雜合子C/G為623、491、132bp三條帶；突變型純合子 G/G為623bp一條帶。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836擴增產物酶切后電泳結果如圖1。

2.2 CYP1B1、Era、PR免疫組化分析

判斷標準:Era、PR、CYP1B1著色部位在細胞核，胞核有棕黃色顆粒即判斷為Era、PR、 CYP1B1表達陽性。陽性細胞數<5%記為陰性(-)，陽性細胞數>5%記為陽性(+)。不同CYP1B1基因型Era、PR表達情況，見表1。

表1 CYP1B1基因多態性與ERa, PR表達

通過χ2檢驗，各基因型與ERa, PR陽性表達之間的差異沒有顯著性，按照常規比較方法，將CYP1B1 rs1056827、1056836 GT、TT，CG、GG基因型合并后比較，基因型與ERa, PR陽性表達之間的差異也沒有顯著性，因此CYP1B1 rs 1056827，1056836基因多態性與ERa, PR陽性表達之間可能沒有關系。120例乳腺癌病理組織及癌旁組織CYP1B1表達分別為106和0例，說明CYP1B1的過表達與乳腺癌相關。

3 討論

有研究認為腫瘤組織CYP1B1 rs1056836基因多態性與ERa, PR陽性表達之間相關[2]，也有研究認為乳腺癌腫瘤組織CYP1B1 rs1056836基因多態性與ERa, PR陽性表達之間不相關[3]，本研究結果與劉春蓮研究結果相同，即CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多態性與ERa, PR陽性表達之間沒有關系。有研究者認為CYP1B1在多種腫瘤組織中(如乳腺、子宮、腎、結直腸等)特異性高表達，而在相應的正常組織中不表達[1]，我們的研究與文獻報道一致，即CYP1B1在腫瘤組織表達率非常高，而在非腫瘤組織中不表達，本研究證實了這種理論。

[1]肖昌瓊，周宏灝.細胞色素P450藥物氧化酶基因多態性與乳腺癌易感性研究進展[J].中國腫瘤，2009，18(1):38-40

[2]朱壯彥,糜若然,劉靜，等.CYP1B1基因多態性與卵巢癌易感性的研究[J].現代婦產科進展，2006,15(3):184-187

[3]劉春蓮，顧繼偉，彭亮，等.CYP1B1 SNPrs1056836、ER和PR與寧夏漢族乳腺癌遺傳易感性研究[J].中國腫瘤，2009,18(1):31-33

[4]陳悅，鄧覲云，李張云，等.乳腺癌CYP1B1基因與ER、PR的表達關系及臨床意義[J].江西醫藥，2009，44(12)：1176-1178