柳蘭鞣質含量動態分析及體外抗氧化作用研究

劉 娟，郝春艷，李鳳偉

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

柳蘭(Chamaenerion angustifoliu)為柳葉菜科柳蘭屬多年生草本植物[1，2]，異名糯芋(云南)、大救駕(湖北) 、山麻條(四川) ，又名紅筷子。柳蘭全草入藥，性辛、苦、平，有小毒，具有調經活血及消腫止痛的功效，用于治療骨折、關節扭傷、月經不調、陰囊腫大等癥[3]。目前已經從柳蘭中分離出了4個黃酮類化合物和9個鞣質及其小分子多元酚類化合物[4，5]。其提取物具有抗腫瘤和抗炎作用[6，7]。鞣質也稱單寧，是一類水溶性的含多酚羥基結構的化合物，其具有較強的化學活性及生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗衰老、止血作用等[8]。通過對相關文獻的查閱，目前尚未見有對其鞣質含量測定及其所含化學成分鞣質的體外抗氧化活性的相關報道，因此本文以柳蘭鞣質含量變化為指標，采用紫外分光光度法測定了不同生長期柳蘭中鞣質的含量，研究柳蘭中鞣質的動態積累規律，并測定其鞣質成分的體外抗氧化活性，為柳蘭的開發利用及藥材采收加工提供科學依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 試驗材料

柳蘭樣品分別于2013年5～8月采自黑龍江省佳木斯市湯原縣葫蘆島，經佳木斯大學生藥學教研室劉娟教授鑒定為柳葉菜科植物柳蘭(Chamaenerion angustifoliu)。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計 (上海棱光技術有限公司)，電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)，HH - 2.4型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)，微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 試驗試劑

沒食子酸標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0831-9501)；DPPH標準品(Sigma公司)；鄰苯三酚、丙酮、鉬酸鈉、硫酸鋰、鎢酸鈉、鹽酸、溴、磷酸均為分析純。干酪素為化學純。

2 方法與結果

2.1 柳蘭鞣質的含量測定

2.1.1 溶液的配制

磷鉬鎢酸試液的配制：稱取鉬酸鈉25g、鎢酸鈉100g，加入水700mL將其溶解，再加入磷酸50mL、鹽酸100mL，加熱回流10h，冷卻，繼續加入硫酸鋰150g、水50mL和液溴0.2mL，加熱煮沸約15min以除去殘留的溴，用水稀釋至1000mL，過濾，收集濾液，即得黃色磷鉬鎢酸試液。對照品溶液的制備：準確稱取沒食子酸對照品50mg，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，準確量取上述溶液5mL，置于50mL棕色容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.05mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取過四號篩的柳蘭干燥全草粉末1g于三頸瓶中，以60%丙酮為溶劑，料液比為1:20，70℃水浴回流2h，濾過，定容于25mL容量瓶中，從中精密量取5mL定容于100mL容量瓶中，即為供試品溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制

準確移取沒食子酸對照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分別置于25mL棕色容量瓶中，再各加入磷鉬鎢酸試液1mL，分別加入水11.5mL、11mL、10mL、9mL、8mL、7mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，避光靜置30min。以相應的試劑作為空白，照紫外可見分光光度法，在760nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=101.7x+0.022。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.1.3 含量測定條件的選擇

顯色時間：根據2010年版《中國藥典》方法，樣品溶液中加入顯色劑靜置30min后，其中的酚酸可與顯色劑完全反應，經穩定性考察表明，溶液顯色后在3 h內穩定。因此選擇顯色時間為30 min，并且在3 h內測定吸光度。

干酪素用量：分別準確稱取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9g干酪素，沉淀等量的樣品(供試品溶液25mL)。結果表明，隨著干酪素用量的增加，游離多酚的含量逐漸減少，當干酪素用量達0.8g時，溶液中的游離多酚含量不再減少，說明其中的鞣質已被干酪素吸附完全。由此確定干酪素用量為0.8g。

2.1.4 鞣質含量測定方法

總酚：精密吸取一定量的供試品溶液，置于25mL棕色容量瓶中，按照標準曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，再加水補至13mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。依法測定溶液吸光度，在標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算即得。

不被吸附的多酚：準確量取供試品溶液25mL，加于已盛有干酪素0.8g的100mL具塞錐形瓶中，密封，置于30℃水浴中，保溫1h，每隔5min振搖一次，取出放冷，搖勻，過濾，棄去初濾液，準確量取續濾液5mL，置于25mL棕色容量瓶中，按照標準曲線制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，再加水補至13mL，以29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。依法測定吸光度，在標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算即得。

按照下式計算鞣質的含量：

鞣質含量=總酚的量-不被吸附的多酚量

2.1.5 方法學考察

精密度試驗：準確移取供試品溶液1mL，按照總多酚含量測定的方法，測定樣品的吸光度，連續測定6次，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

穩定性考察：準確移取同一供試品溶液1mL，按照總多酚含量測定方法進行顯色，分別在顯色后0.5，1，1.5，2，2.5，3 h測定溶液的吸光度。結果表明，隨著顯色后放置時間的延長，樣品溶液的吸光度在逐漸的下降，但在3 h內溶液吸光度的RSD為2.6%(n=6)，表明樣品顯色后至少在3h內穩定。

重復性考察：取6份同一柳蘭樣品粉末1g，平行制備供試品溶液6份，按“2.1.4”項下方法測定鞣質含量，結果鞣質含量平均為12.07%，RSD為2.3%，結果表明此方法重復性良好。加樣回收率考察：取同一柳蘭樣品粉末9份，每份1g，精密稱定，平行制備供試品溶液，分別加入一定量的沒食子酸對照品溶液，使得沒食子酸的加入量為柳蘭樣品中總多酚含量的50%(3份)、100%(3份)和150%(3份)。按照總多酚含量的測定方法測定樣品中總多酚含量，計算其加樣回收率，結果其平均加樣回收率為99.03%，RSD為2.55%。

2.1.6 柳蘭樣品含量測定

取不同采收時期柳蘭全草干燥粉末各1g，供制備試品溶液，準確移取供試品溶液1mL，在“2.1.4”項條件下顯色，測定其吸光度，每個樣品平行測定兩次，取平均值，計算鞣質含量。

表1 不同采收期柳蘭中鞣質的含量測定(%，n=2)

研究結果表明柳蘭中鞣質含量隨著生長期不同呈規律性變化，不同時期柳蘭中鞣質含量由高到低依次為：花蕾期>花果期>幼苗期>果期。

2.2 柳蘭鞣質的純化

取提取液適量，加入過量1%熱明膠溶液，使其充分沉淀，直至沉淀不再產生為止，過濾，將沉淀置于丙酮中，過濾，減壓回收溶劑至干，即得柳蘭鞣質提取物粉末。

2.3 柳蘭鞣質體外抗氧化活性評價

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用

分別取不同濃度(0.002、0.004、0.006、0.008、0.01mg/mL)的柳蘭鞣質溶液2.0mL于試管中，分別加入DPPH溶液2.0mL，于37℃避光反應30min，在517nm波長處測定其吸光度值(AS)。同時，在517nm處測定不同濃度樣品2.0mL加乙醇2.0mL的吸光度值(AC)，乙醇2.0mL 加DPPH 2.0mL的吸光度值(A0)。并計算DPPH自由基清除率。以Vc溶液作為陽性對照。其清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(AS-AC)]/A0×100%

圖2 柳蘭鞣質對DPPH的清除能力

圖3 Vc對DPPH的清除能力

維生素C和柳蘭鞣質對DPPH自由基均有清除作用，隨著濃度升高，清除率增大，其IC50值分別為0.00502mg/L和0.00632mg/mL，二者較為接近，表明柳蘭鞣質具有較好的清除DPPH自由基的作用。

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

在試管中準確加入5mL Tris-HC1緩沖溶液(pH=8.2)和2.0mL不同濃度的樣品(0.008mg/mL，0.016mg/mL，0.024mg/mL，0.032mg/mL，0.04mg/mL)，混勻后在25℃恒溫水浴中反應20min，取出后迅速加入50μL經25℃預熱的5mmol/L的鄰苯三酚，搖勻后立即倒入比色皿中，于325nm處以30s為時間間隔，掃描其在5min內的OD值。以同樣操作的2.0mL超純水代替樣品溶液作為平行對照，以同樣操作的Vc溶液作為陽性對照組，以pH=8.2的Tris-HC1緩沖溶液為空白對照。根據鄰苯三酚每分鐘自氧化率計算抑制率，按照下列公式計算：

抑制率(%)=(ΔA0/Δt-ΔA1/Δt)/(ΔA0/Δt)

ΔA0/Δt—平行對照組鄰苯三酚在該時段的自氧化率；

ΔA1/Δt—加入樣品后鄰苯三酚在該時段的自氧化率；

由圖可知，維生素C和柳蘭鞣質對超氧陰離子自由基清除作用均隨著濃度的增加而增強，其IC50值分別為0.01mg/mL和0.028mg/mL，說明柳蘭鞣質具有一定抗超氧陰離子自由基的活性，但較維生素C弱。

圖4 柳蘭鞣質對超氧陰離子自由基的清除作用

圖5 Vc對超氧陰離子自由基的清除作用

3 討論

采用紫外分光光度法測定柳蘭鞣質，經過方法學的驗證，其試驗穩定性、儀器精密度、加樣回收率及方法重現性均達到分析要求，且該方法簡便快捷，準確性高，操作簡單、省時、取樣量少，適用于柳蘭鞣質的含量測定。但其干酪素用量對實驗結果具有一定影響，因此本實驗對干酪素用量進行了考察，將其可吸附多酚完全吸附，確保了結果的準確性。研究結果顯示柳蘭中鞣質含量隨著生長期不同呈規律性變化，在花蕾期含量最高，含量為12.50%，果期含量最低，含量為5.32%，這可能是由于其生長環境、陽光、溫度、降水量等條件的改變所致。該結果表明，若以鞣質作為其有效成分之一，柳蘭藥材的最佳采收期為花蕾期。

本實驗通過對柳蘭鞣質體外抗氧化活性的研究，表明柳蘭鞣質對于DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有一定的清除作用。表明柳蘭在醫藥、保健品等行業的應用具有遠大前景。

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