明膠/聚己內酯納米纖維電紡膜在表皮組織工程中的應用

吳巍段惠川張文杰曹誼林

A：表皮細胞系在膜片表面接種第1和第7天的掃描電鏡圖（標尺：200 μm）；B：表皮細胞系在膜片表面接種第1和第7天的激光共聚焦熒光圖片（標尺：100 μm）；C：CCK-8法檢測表皮細胞系在膜片表面接種后的增殖情況A:SEM images of HaCaT cells on GT/PCL membrane at day 1 and day 7(Scale bars:200 μm);B:Confocal microscope images of HaCaT cells on GT/PCL membrane at 1st day and 7th day(Scale bars:100 μm);C:Proliferation of HaCaT cell on GT/PCL membrane measured by CCK-8 kit

明膠/聚己內酯納米纖維電紡膜在表皮組織工程中的應用

吳巍段惠川張文杰曹誼林

目的觀察明膠/聚己內酯（GT/PCL）納米纖維電紡膜應用于表皮組織工程的可行性。方法測定HaCaT細胞（人類表皮細胞系）與電紡膜的生物相容性，并對于接種細胞前后該膜片的機械性能進行評價。應用CCK-8法檢測細胞增殖情況。體內研究檢測GT/PCL納米纖維電紡膜構建的組織工程化表皮修復裸鼠皮膚缺損的效果。結果HaCaT細胞能夠在膜片上很好地附著和增殖，該膜片具有良好的生物相容性。機械性能測試顯示，該膜片具有足夠的力學特性以用于移植。體內研究表明，應用GT/PCL納米纖維電紡膜構建的組織工程化表皮能夠修復裸鼠的皮膚缺損。結論GT/PCL納米纖維電紡膜是一種適合構建組織工程化表皮的支架材料。

表皮組織工程納米纖維電紡膜明膠聚己內酯

大面積皮膚缺損的治療常面臨供體皮膚不足的問題。皮膚組織工程為此提供了一個新的方向[1]。早期研究中，人們將自體角質形成細胞（KC）進行體外培養擴增，構建形成細胞膜片應用于臨床[2]。然而，細胞膜片的機械強度過低，限制了其臨床使用。為了提高移植物的機械性能，各種可以支持角質細胞生長的膜片支架材料受到關注[3-6]。支架材料可以是各種天然的基質材料，也可以是各種人工合成的材料，或者是兩者結合的產物。

理想的表皮組織工程支架材料，應當首先具有足夠的機械性能，以便支撐移植物從培養皿轉移至創面；其次，具有良好的生物相容性；另外，支架材料的質量應該是可控的。靜電紡絲技術，可以經濟便捷地大規模生產出具有良好穩定性的纖薄的納米纖維膜，為表皮組織工程支架材料提供了可能的解決方案。靜電紡納米纖維具有類似細胞外基質（ECM）的天然形貌特征，可促進細胞的增殖、遷移等功能[7-9]。幾種靜電紡絲納米纖維膜已開始應用于表皮組織工程的研究，包括純天然材料制造或天然材料與人工合成材料的混合物[3，5，10-14]。混合材料充分結合了天然材料和人工合成材料的優點，顯示出了具大的應用前景。目前已有應用明膠和聚己內酯相混合的靜電纖維電紡膜（GT/PCL靜電纖維電紡膜）的報道，其中明膠（GT）的存在，提高了膜片的生物降解性和生物相容性；而聚己內酯（PCL）則提高了膜片的機械性能，該混合材料已用于皮膚和神經組織工程[12-15]。

然而，在GT和PCL的靜電紡絲過程中，因兩者的親水性不同，易出現相分離情況，影響纖維的各種性能。在超微結構水平的纖維不均一性可能導致纖維的性能不佳（如機械性能的減弱）[16-18]。為了解決相分離的相關問題，我們在之前的實驗中使用了微小量的醋酸（＜0.3%）來改善材料的相溶性，使最初的混濁溶液在1周以內能始終保持澄清的單一穩定液相。以此制備的納米纖維也更薄，表面更光滑，結構均一，顯示出良好的親水性和力學性能[19]。

本研究應用上述改良的GT/PCL靜電纖維電紡膜來進行體內與體外實驗。體外實驗中，我們將HaCaT細胞種植于改良的GT/PCL納米纖維電紡膜，檢測電紡膜的機械性能和生物相容性；體內試驗，則通過移植HaCaT電紡膜組、人角質形成細胞電紡膜組和單純電紡膜組（GT/PCL靜電纖維電紡膜組）所構建的組織工程表皮來修復裸鼠皮膚損傷，對改良的GT/PCL靜電纖維電紡膜在表皮組織工程的應用價值進行評估。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、設備

中性蛋白酶（Roche公司，德國）；I型膠原酶（Worthington公司，美國）；DMEM培養液、dK-SFM培養液（Gibco公司，美國）；HLA-ABC抗體（Abcam公司，美國）。

恒溫CO2培養箱（Forma Scientific公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（萊卡公司，德國）；冰凍切片機（SHANDON公司，美國）；真空冷凍干燥機（Virtis Benchtop公司，美國）；FCM（Beckman公司，美國）；酶標儀（Thermo公司，美國）。

1.2 GT/PCL膜的制備

將24孔（直徑1.56 cm）圓形蓋玻片上的材料置于10 cm無菌培養皿中，利用真空冷凍干燥機進行過夜冷凍干燥處理，對GT/PCL納米纖維電紡膜進行消毒殺菌。次日收集材料，備用。

1.3 HaCaT細胞的擴增

將HaCaT細胞（上海復翔生物）以0.05%胰蛋白酶37℃消化30 sec，DMEM終止消化，吹打細胞，所得細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清，DMEM重懸，接種于10 cm培養皿，每3天換液。當細胞匯合達90%，以PBS沖洗細胞，0.05%胰蛋白酶37℃消化30 sec，DMEM終止消化，吹打細胞，所得細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清，DMEM重懸，以2.5×104cells/cm2的密度接種于培養皿，每3天換液。

1.4 人角質形成細胞的獲取及培養

本研究中所使用的人角質形成細胞取自于小兒包皮環切手術后所廢棄的包皮組織（上海兒科醫院泌尿外科），患兒年齡6～10歲，均獲得患兒家屬的知情同意。

將所獲得的包皮組織，以氯霉素液沖洗5遍，PBS溶液浸洗2遍，清除皮膚表面的血漬和多余的脂肪組織；將標本分離為0.5 mm×0.5 mm大小，PBS溶液浸洗2遍；使用1 U/mL的配制好的Dispase溶液置于37℃搖床中消化2 h后，分離獲得表皮層。并將分離的表皮組織盡量剪碎，以0.05%胰酶置于37℃搖床中振蕩消化10～15 min，用含10%無鈣血清培養液終止消化，將細胞懸液經過40 μm單細胞濾器過濾，以2 000 r/min離心5 min，棄上清，以dK-SFM培養液重懸細胞，取少量細胞進行細胞計數。最后以2 000 cells/cm2的細胞密度接種于10 cm培養皿上，置于37℃、含21%O2培養箱中培養，3 d換液一次。待細胞匯合至80%時，以0.05%胰蛋白酶置于37℃培養箱中消化5 min后，以無鈣血清終止消化，將細胞懸液以2 000 r/min離心約5 min，棄上清，dK-SFM培養液重懸，以2 000 cells/cm2的密度進行傳代。

1.5 共聚焦顯微鏡分析

細胞接種后第1、7天取出膜片，PBS沖洗，4% PFA室溫固定15 min后，以DAPI襯核。熒光封片劑封片后進行共聚焦顯微鏡觀察。

1.6掃描電鏡（SEM）觀察

細胞接種后第1、7天，將細胞-材料復合物取出，固定，磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，乙醇濃度依次為：25%、50%、75%、85%、95%和100%，每個梯度脫水5 min。預先配制無水乙醇與六甲基二硅胺烷的混合液，配制比例依次為：3∶1、1∶1、1∶3和0∶1，然后將樣品在各混合液中浸泡10 min，置入通風櫥內自然風干。導電膠固定，噴金，行掃描電鏡檢測[12]。

1.7 細胞增殖實驗

按CCK-8試劑盒說明，在24孔培養板上以5×104個/孔的細胞密度將HaCaT細胞接種于GT/PCL納米纖維電紡膜表面，選取第1、3、5、7天4個時間點進行檢測。檢測當天吸除孔中原有培養液，每孔再加入500 μL新鮮培養液及50 μL CCK-8試劑，置于37℃恒溫CO2培養箱2 h，然后每孔吸取100 μL培養液于96孔板中，450 nm處測定每孔吸光度值。1.8生物力學測試

將所得的GT/PCL納米纖維電紡膜放入真空干燥箱中干燥，然后將試樣貼在載物臺上鍍金90 sec，在10 KV的加速電壓下，用掃描電鏡觀察靜電紡納米纖維的形態并拍照。基于所得SEM圖像，使用分析軟件（NIH，USA）對制備的靜電紡絲納米纖維的直徑、孔徑大小進行測量，并使用游標卡尺測量膜片的厚度。

力學測定：制備具有一定長、寬及厚度的纖維膜；將纖維膜固定在模板的兩端，將纖維膜裁剪為長5 cm、寬1 cm、厚0.1～0.2 mm的樣品；小心剪去模板中間3 cm部分。分為4組：單純材料培養液中浸泡8 h、1周、2周以及細胞接種后培養1周，每組5個樣本進行檢測。將所得樣品兩端1 cm處固定于材料測試機上，20℃、65%濕度環境下以10 mm/min的拉伸速度對樣品進行拉伸測試。獲得各組的應力-應變曲線、平均斷裂強度、楊氏模量和延伸率。

1.9 裸鼠創面愈合模型實驗

分為3組：第一組，HaCaT細胞接種于GT/PCL納米纖維電紡膜組；第二組，人角質形成細胞接種于GT/PCL納米纖維電紡膜組；第三組，單純材料組（GT/PCL納米纖維電紡膜組）。

將細胞（HaCaT細胞和人角質形成細胞）接種于GT/PCL膜（圓形，直徑1.56 cm），以1×106cells/cm2的細胞密度接種。2 d換液一次。構建7 d后的組織工程表皮用于移植。

12只雄性BALB/C裸鼠購買自SLAC國家嚙齒類實驗動物資源庫（上海）。小鼠腹膜內注射戊巴比妥鈉（20 mg/Kg）麻醉。在裸鼠背部用角膜環鉆造一直徑1 cm的全層皮膚缺損。將12只裸鼠分為3組（membrane、HaCaT、KC），每組以一種制備的材料（n=4）覆蓋，5-0尼龍縫線固定，凡士林紗布和敷料覆蓋。整個實驗過程密切監測動物行為和繃帶完整性。分別在第0、4、7、11、14天評估創面愈合情況。數碼相機拍照，Image-Pro Plus軟件測量面積，計算創面愈合率。創面愈合率的計算公式為：（最初面積-實時面積）/最初面積×100%。

1.10 組織學分析和免疫熒光染色

對術后14 d皮膚組織的冰凍切片進行免疫熒光檢測。所采用的一抗為兔抗小鼠HLA（1∶200）。1.11統計分析

數據以均數±標準差表示。兩因素方差分析用來確定差異有無統計學意義，實驗中的數據統計采用t檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 GT/PCL納米纖維電紡膜的準備

我們使用的是圓形的GT/PCL納米纖維電紡膜，直徑1.56 cm。電鏡分析評估材料纖維的微觀結構，結果顯示，GT/PCL（50∶50）膜片的纖維光滑，均勻，細膩，平均纖維直徑為（409±88）nm，膜片的平均孔徑（7.2±1.5）μm，平均厚度（25±4）μm（圖1）。

2.2 GT/PCL納米纖維電紡膜的生物相容性

為進行GT/PCL納米纖維電紡膜的生物相容性實驗，我們將HaCaT細胞接種于膜的表面。1 d后，共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察顯示，細胞在膜表面不斷增殖，培養7 d后細胞可達到約85%融合。細胞增殖實驗的結果顯示，隨著觀察時間的延長，細胞的OD值也逐漸增加，直到進入平臺期，證明了GT/PCL納米纖維電紡膜具有良好的生物相容性（圖2）。

2.3 GT/PCL納米纖維電紡膜的力學性能

組織工程表皮在移植修復的過程中需要良好的機械強度以利于轉移。觀察4組GT/PCL納米纖維電紡膜（單純材料培養液中浸泡8 h、1周、2周以及細胞接種后培養1周）的應力-應變曲線，結果顯示，各組楊氏模量和平均斷裂強度沒有顯著性差異。GT/PCL納米纖維電紡膜的延伸率則隨著浸泡時間的延長而不斷變大，可能是由于明膠的快速降解導致的。我們發現，接種HaCaT細胞的GT/PCL納米纖維電紡膜片的彈性有所增加（P＜0.05，與單純材料培養液中浸泡1周組相比較）。因此，我們相信該GT/ PCL納米纖維電紡膜的力學強度足以支撐其在體外培養1周以后用于移植修復（圖3）。

2.4 構建的組織工程表皮修復皮膚缺損

分別在術后第0、4、7、11、14天用數碼相機記錄3組（包括HaCaT細胞電紡膜組，人角質形成細胞電紡膜組和單純材料組）修復裸鼠皮膚缺損的大體觀。術后14 d時各組創面愈合。統計分析表明，HaCaT細胞電紡膜組與人表皮細胞電紡膜組，在術后4、7、11 d時，愈合率均顯著高于單純材料組，差異有統計學意義（P<0.05）。但是，術后14 d時各組愈合率均未見顯著差異，單純材料組（94.4±6.8）%，HaCaT細胞電紡膜組（99.7±0.6）%，人角質形成細胞電紡膜組（99.8±0.3）%。綜合分析后，我們認為所構建的組織工程表皮可以加速創面的愈合（圖4、5）。

術后第14天，皮膚修復區域的的組織學檢測顯示，多層再生的上皮組織參與修復了缺損，但缺損部位的再生皮膚缺少正常裸鼠皮膚所具有的皮膚附件等結構。為了進一步確定HaCaT細胞和人角質形成細胞是否參與損傷修復，我們使用抗人表面抗原的HLA進行免疫熒光染色，觀察發現使用構建的組織工程化表皮修復的缺損處的新生表皮層有特異的HLA的表達；而單純材料組則未見HLA陽性表達。表明存活的供體細胞參與了創面的修復（圖6）。

圖1 GT/PCL納米纖維電紡膜的表征Fig.1Characterizations of GT/PCL electrospun nanofibrous membrane

圖2 GT/PCL納米纖維電紡膜的生物相容性Fig.2Biocompatibility of GT/PCL electrospun nanofibrous membrane

A：表皮細胞系在膜片表面接種第1和第7天的掃描電鏡圖（標尺：200 μm）；B：表皮細胞系在膜片表面接種第1和第7天的激光共聚焦熒光圖片（標尺：100 μm）；C：CCK-8法檢測表皮細胞系在膜片表面接種后的增殖情況
A:SEM images of HaCaT cells on GT/PCL membrane at day 1 and day 7(Scale bars:200 μm);B:Confocal microscope images of HaCaT cells on GT/PCL membrane at 1st day and 7th day(Scale bars:100 μm);C:Proliferation of HaCaT cell on GT/PCL membrane measured by CCK-8 kit

圖3 GT/PCL納米纖維電紡膜的機械性能Fig.3Mechanical properties of GT/PCL electrospun nanofibrous membrane

圖4 各組裸鼠表皮缺損修復的觀察Fig.4The observation of the repair of skin defects in each group

圖5 各組傷口愈合率（n=4）（*：P＜0.05，VS單純材料組）Fig.5Wound closure rates in each group(n=4)(*:P＜0.05,compare with membrane alone group)

圖6 術后第14天皮膚修復的組織學觀察（比例尺：200 μm）Fig.6Histological observation in each group 14 days after operation.(Scale bar:200 μm)

3 討論

良好的生物相容性和足夠的力學強度是表皮組織工程對膜片材料的基本要求。GT/PCL納米纖維電紡膜結合了天然和合成材料的優勢。GT是一種細胞外基質的天然成分，可以提供一個理想的環境以利于細胞的黏附、增殖和分化；PCL的降解較慢，可為再生皮膚提供良好的力學性能[20]。前期實驗表明，對于不同比例的GT/PCL膜片材料，隨著GT含量的逐漸增加，材料的細胞黏附能力也逐漸增強，但同時膜片的機械強度隨著PCL含量的降低而下降。與此相反，PCL含量的增加，雖然改善了機械強度，但導致細胞黏附能力明顯減弱。體內外實驗表明，我們采用改良的GT/PCL納米纖維電紡膜片，能較好地適用于表皮組織工程的研究。

GT/PCL納米纖維電紡膜的降解速率相對緩慢。在軟骨組織工程的構建中，9個月時依然可以觀察到未降解的PCL材料（本實驗室的研究資料）。因此，GT/PCL納米纖維電紡膜支架在表皮組織工程的應用過程中主要承擔的是表皮細胞增殖載體的作用。GT/PCL納米纖維電紡膜覆蓋創面以后，隨著創面的逐漸愈合，電紡膜最終會與表皮脫離。因此，GT/ PCL納米纖維電紡膜過慢的降解速率不會影響表皮的修復過程。本實驗室既往的研究表明，殼聚糖-明膠膜片（CGMS）同樣也是一種降解速率過慢的材料，但在動物模型與臨床治療過程中，都有良好的效果[21-22]。而相較于CGMS膜片，GT/PCL納米纖維電紡膜可以提供一個仿生學微環境，以利于細胞的黏附和增殖。此外，GT/PCL納米纖維電紡膜的纖維網結構可以提供更好的透氣性，并且易于液體的通過，炎性因子和滲出液能夠更好的擴散。基于以上優勢，GT/PCL納米纖維電紡膜構建的組織工程表皮修復皮膚損傷時將具有更好的效果。

創傷修復包括各種生長因子和細胞分泌因子的動員，細胞的增殖以及血管再生等過程[23]。本研究中的組織工程化表皮，可以通過加快創面的早期愈合速度來提高愈合速率。但我們也發現，單純材料組處理的創面在術后第14天也實現了愈合。這可能是由于小鼠模型的皮膚自身收縮所致。雖然在實驗組中我們也發現了皮膚的收縮，但是HLA染色顯示創面所覆蓋的移植細胞存活，表明該供體細胞在促進愈合過程中也發揮了明顯作用。研究表明，組織工程表皮不僅可以覆蓋創面，而且還可以分泌刺激皮膚再生的各種生長因子[24-26]。因此，也有研究使用包被有各種細胞生長因子的膜片來治療皮膚損傷。Choi等[27]將重組型人EGF包埋于靜電紡纖維支架材料來治療糖尿病引起的皮膚潰瘍。其他細胞因子，包括G-CSF和PDGF-BB等，也都被應用于皮膚組織工程[28-30]。因此，包埋有不同生長因子的GT/PCL納米纖維電紡膜的研究將成為后續實驗的側重點。

GT/PCL納米纖維電紡膜由于較少引起宿主的免疫反應，被認為是一種很有前景的組織工程支架材料[31]。明膠是一種天然細胞外基質，在修復大鼠皮膚缺損的過程中僅引起極小的炎性反應[32]。而PCL由于其本身的惰性，在修復皮膚缺損的過程中幾乎不會引起炎癥反應[33]。研究中，我們同樣沒有發現明顯的免疫反應。至于GT/PCL納米纖維電紡膜對于感染創面是否具有抗炎作用，則值得進一步研究。此外，我們也可以考慮將抗生素包埋于納米纖維電紡膜中用于感染性皮膚損傷的修復[34]。

4 結論

目前的研究表明，改良的GT/PCL納米纖維電紡膜具有良好的生物相容性和力學性能，是一種良好的組織工程表皮支架材料。

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Electrospun Nanofibrous Gelatin/Polycaprolactone Membrane for Epidermis Engineering

WU Wei1,DUAN

Huichuan2,ZHANG Wenjie2,CAO Yilin2.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com);ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo investigate the feasibility of a modified gelatin and polycaprolactone(GT/PCL)electrospun nanofibrous membrane for epidermis engineering.MethodsThe biocompatibility of the membrane was evaluated by seeding HaCaT cells(human keratinocyte cell line)on the membrane and the mechanical properties of the membrane were determined before and after seeding HaCaT cells.Cell proliferation assay was tested by CCK-8 kit.Then the outcome of GT/ PCL membranes repairing skin defects in the nude mouse was investigated.ResultsThe cell proliferation assay showed good attachment and proliferation of HaCaT cells on the membranes and demonstrated good biocompatibility of the membranes.The membranes were strong enough to be transplanted confirming by mechanical test.Further in vivo transplantation studies revealed that engineered epidermis with GT/PCL membranes are able to repair skin defects of the nude mouse.ConclusionThe modified GT/PCL electronspun nanofibrous membrane is a kind of suitable scaffold for epidermis engineering.

Epidermis skin engineering;Electrospun nanofibrous membrane;Gelatin;Polycaprolactone

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）02－0061－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.001

2014年1月6日；

2014年1月24日）

國家重點基礎研究發展計劃（2007CB948004，2011CB964704）；國家重點基礎研究發展計劃（30800231，31170944）；上海基礎研究發展計劃（10ZR1424400）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科（吳巍，曹誼林）；200011上海市上海組織工程研究重點實驗室（段惠川，張文杰，曹誼林）。

曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）；張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。

注：吳薇和段惠川為共同第一作者。