5-氟尿嘧啶醇脂體抑制瘢痕成纖維細胞的實驗研究

張錚沃雁張振毛小慧蘇薇潔濮哲銘張艷章一新

5-氟尿嘧啶醇脂體抑制瘢痕成纖維細胞的實驗研究

張錚沃雁張振毛小慧蘇薇潔濮哲銘張艷章一新

目的構建納米級載5-氟尿嘧啶醇脂體（5-FU ES），觀察其對瘢痕成纖維細胞的抑制作用。方法采用Touitou法制備5-FU ES懸液并進行質量評價。體外培養增生性瘢痕成纖維細胞，熒光素RhoB標記醇脂體，進行體外透細胞實驗，以水醇溶液為對照。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察不同作用時間后細胞內熒光分布和強度。CCK-8檢測不同濃度5-FU ES對成纖維細胞活性的影響，計算載5-FU ES對成纖維細胞活性的半數抑制濃度（IC50）。CCK-8檢測醇脂體對瘢痕成纖維細胞生長的影響。結果制備所得5-FU ES粒徑為（87.5±5.4）nm，分散系數為0.151±0.27，包封率為（10.03±2.12）%。CLSM圖像顯示，醇脂體促進RhoB進入細胞內，可見熒光分布和強度均較水醇溶液組增多增強；經Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積光密度值，RhoB標記醇脂體組（Rho ES）細胞內熒光光密度顯著高于水醇溶液組（Rho HA）（P<0.01）。隨著5-FU濃度增加，5-FU HA和5-FU ES對成纖維細胞的生長抑制率逐漸增強；5-FU ES和5-FU HA對成纖維細胞的半數抑制濃度（IC50）分別為（9.2582±1.2329）μg/mL和（18.0352±2.3145）μg/mL，差異具有統計學意義（P<0.05）；同時，醇脂體本身對細胞活性無明顯抑制作用。結論醇脂體可有效攜帶5-FU向瘢痕成纖維細胞內遞送，促進5-FU對成纖維細胞的活性抑制作用。醇脂體作為經皮給藥載體，是一種安全有效的透細胞藥物載體。

醇脂體5-氟尿嘧啶增生性瘢痕成纖維細胞細胞內遞送

目前，瘢痕的治療方法眾多，但效果均不理想[1]。瘢痕內藥物注射是目前常用的方法，但不良反應較多，如過敏反應[2]、皮膚萎縮[3]等，且注射過程疼痛劇烈，患者接受度低[4]。經皮給藥能夠避免上述不良反應，但因皮膚的屏障作用和瘢痕組織致密的結構特點，造成藥物不易滲透進入瘢痕組織，無法在局部形成有效的藥物濃度。隨著透皮研究的發展，醇脂體被證明是最為有效的透皮藥物載體之一[5-6]。

5-FU通過干擾瘢痕成纖維細胞DNA的復制和轉錄，抑制細胞的增殖和膠原蛋白過度表達，以減輕瘢痕增生和膠原沉積[7-8]。也就是說，5-FU必須由外界進入瘢痕組織，并進入成纖維細胞內才能發揮抑制瘢痕作用。我們在前期體外透瘢痕研究中初步證實，載5-FU醇脂體可有效滲透入瘢痕組織，并在局部獲得較高的藥物滯留量[9-11]。但是，進入瘢痕組織后的載藥醇脂體，能否進一步克服細胞膜屏障，將5-FU遞送至成纖維細胞內發揮細胞抑制作用，尚有待進一步的實驗研究。

本研究采用熒光素標記醇脂體，通過體外透瘢痕成纖維細胞實驗，以明確醇脂體是否能夠有效進入細胞內，并檢測了載5-FU醇脂體對體外瘢痕成纖維細胞活性的影響，旨在為經皮給藥治療瘢痕提供初步的實驗依據。

1 儀器與方法

1.1 試劑、儀器

試劑：5-FU（上海國藥集團化學試劑公司），大豆卵磷脂（磷脂酰膽堿，含量≥94%，德國Lipoid GmbH），羅丹明B（美國Sigma），細胞增殖/毒性檢測試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化學研究所），其余試劑均為分析純。

儀器：JEM-2012透射電子顯微鏡（日本JEOL Inc），FEF Sirion 200掃描電子顯微鏡（英國Oxford Inc），380zls NICOM激光粒度儀（美國PCS），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica Microsystems Heidelberg GmbH），2695高效液相色譜分析儀（美國waters），LiposoFast薄膜擠出儀和擠出模（加拿大Avestin Inc），CO2培養箱（美國Forma Scientific），恒溫搖床（美國Forma Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 醇脂體的制備和質量評價

1.2.1.1 載5-FU醇脂體的制備

[12-13]的方法，秤取一定量的PC溶解于無水乙醇中作為油相，將5-FU溶于PBS（pH 7.4）中作為水相。室溫條件下，將水相以70 μL/sec注入油相中，以700 r/min的速度持續攪拌混合30 min，隨后超聲20～30 min。室溫冷卻靜置30 min。利用擠出儀將醇脂體混懸液通過50 nm孔徑的聚碳酸酯膜，制備得納米級載5-FU醇脂體懸液，其中含0.4%5-FU（w/v）、2%PC（w/v）和30%乙醇（v/v）。同上法制得RhoB標記的醇脂體。

1.2.1.2 載5-FU醇脂體的質量評價

用透射電鏡和掃描電鏡觀察5-FU醇脂體的形態。用激光粒度儀（波長635 nm，25℃）檢測5-FU醇脂體的粒徑大小和分布。采用微柱離心法測量醇脂體的包封率（Entrapment efficacy，EE）[14]：取1 mL注射針筒，底部放置與針筒內徑一致的圓形濾紙，加入用PBS溶脹的Sephadex G50凝膠，將裝好的注射器放入離心管內，2 000 r/min離心3 min，除去多余PBS后形成凝膠柱；吸取5-FU醇脂體0.2 mL，加于柱頂，3 000 r/min離心5 min，收集洗脫液（T1）。于柱頂部加入相同體積PBS，3 000 r/min離心3 min，收集洗脫液（T2），重復該步驟8次，收集洗脫液（T3～T10），記為T2～10。利用高效液相色譜分析儀（High performance liquid chromatography，HPLC）分別檢測T1和T2～T10中5-FU含量。5-FU醇脂體的包封率為EE=m1/(m1+m2)×100%。其中：m1為包封在醇脂體中的5-FU的質量，即洗脫液T1中5-FU質量，m2為未包封在醇脂體中的5-FU的質量，即反復加入PBS后收集到的洗脫液T2～T10的5-FU的質量。

1.2.2 體外培養人增生性瘢痕成纖維細胞

本研究所用的人體增生性瘢痕均來自于我科住院患者，22～31歲女性，或患者知情同意。將切取的標本用氯霉素溶液和無菌PBS溶液沖洗，去除標本表皮及脂肪等皮下組織，將真皮層瘢痕組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小。將剪碎的組織移入50 mL無菌離心管中，加入約10倍于組織體積的0.3%無菌膠原酶溶液，密封，37℃振蕩器中消化3～4 h。過濾消化液,除去未消化的組織殘渣，過濾液1 500 r/min離心10 min，棄上清，離心管內加入適量含10%FCS的DMEM培養液，吹打混勻成細胞懸液，移入無菌細胞培養皿中，置于培養箱中培養。原代細胞培養24 h后更換培養液，48 h后傳代；傳代培養細胞一般3 d更換培養液，當貼壁細胞鋪滿培養皿底部時傳代。實驗所用細胞一般取第4～6代成纖維細胞。

1.2.3 體外透瘢痕成纖維細胞實驗

取6孔板，每孔放置一片無菌蓋玻片。將成纖維細胞以1×104個/孔的密度鋪種于6孔板中，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養24 h。將孔內培養液換成無血清培養液，培養1 h，換成含血清培養液，每孔加入50 μL熒光標記醇脂體懸液，分別培養1 h、4 h和8 h。對照組：含熒光素的30%水醇溶液（30%EtOH）；空白對照組：PBS溶液。培養終點，吸除孔內溶液，用PBS洗滌3遍，每孔加入含10%胎牛血清（FCS）的PBS 2 mL，觀察前在蓋玻片上滴一滴70%甘油溶液消除氣泡，置于CLSM下觀察。參數設置：熒光素Rho B激發波長為552 nm，發射熒光波長為610 nm，為紅色熒光。放大倍率：63.0×1.40油鏡。

1.2.4 體外瘢痕成纖維細胞抑制實驗

1.2.4.1 不同濃度5-FU醇脂體對瘢痕成纖維細胞的抑制作用

5-FU醇脂體體外培養人增生性瘢痕成纖維細胞。取24孔細胞培養板，每孔加入0.4×104cells/mL的細胞懸液1 mL。恒溫培養箱內培養24 h后更換培養液，每孔加入800 μL新鮮培養液，分別向孔內加入80 μL各組溶液，輕輕混勻。置于恒溫培養箱內培養，72 h后取各組培養細胞，更換含10%（v/v）CCK-8試劑的新鮮培養液800 μL，混勻后放入恒溫培養箱培養，1 h后取出，將各組孔內上層溶液轉移至96孔培養板，酶標儀450 nm波長測定各孔溶液吸光度值（A值）。設置調零組和空白組，每組5個復孔，結果重復3次。實驗組：5-FU濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的醇脂體懸液；②對照組：5-FU濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的水醇溶液；③空白對照組：不含5-FU的PBS溶液；④調零組：無細胞孔，加入溶液同空白組。

其中，AbsT=（實驗組A值-調零組A值），AbsC=（空白組A值-調零組A值）。以5-FU濃度為橫坐標，以細胞生長抑制率為縱坐標，計算細胞生長抑制50%時的各組溶液中的5-FU濃度，作為對成纖維細胞的半數抑制濃度（IC50）。

1.2.4.2 醇脂體對瘢痕成纖維細胞生長的影響

從實驗1.2.4.1中得出5-FU ES對成纖維細胞有效抑制濃度，在該濃度下用CCK-8法檢測空載醇脂體懸液作用72 h后，對成纖維細胞活性的影響。

1.2.5 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.15 -FU醇脂體的質量評價

5-FU ES為完整的球形或橢球形囊泡，粒徑在100 nm以內，大小均一（圖1）。激光粒度儀測得的5-FU ES的平均粒徑為（87.5±5.4）nm，多項分散系數（PDI）為0.151±0.27。包封率為（10.03±2.12）%。

2.2 體外透瘢痕成纖維細胞實驗

隨著作用時間延長，醇脂體組細胞內熒光分布逐漸增多增強，而水醇溶液組細胞內熒光也有增多趨勢，但熒光強度始終較弱，明顯低于醇脂體組（圖2）。通過單位面積光密度的計算，醇脂體組細胞內熒光光密度始終明顯高于水醇溶液組（圖3），差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 體外瘢痕成纖維細胞抑制實驗

隨著5-FU濃度增加，5-FU HA和5-FU ES對成纖維細胞的生長抑制率逐漸增強，尤其5-FU濃度在10 μg/mL及以上時，可顯著抑制成纖維細胞的生長（圖4）。5-FU ES對成纖維細胞的抑制作用大于5-FU HA，差異顯著（P＜0.05）。通過計算得出，5-FU HA及5-FU ES對成纖維細胞活性的IC50分別為（18.035±2.056）μg/mL及（9.258±1.397）μg/mL，差異顯著（P＜0.05）。制備10 μg/mL 5-FU ES及相同體系的空載ES，比較兩組作用72 h后對成纖維細胞活性的影響，其中空白對照組、ES組、5-FU ES組A值分別為（0.687±0.029）、（0.643±0.317）、（0.191±0.010）。比較發現5-FU ES組較空白對照組和ES組A值明顯下降（P＜0.05），而ES組與空白對照組沒有明顯差異（P＞0.05）（圖5）。

圖1 透射電鏡和掃描電鏡下載5-FU醇脂體的形態Fig.1TEM and SEM observation of 5-FU Ethosomes

圖2 Rho醇脂體和Rho水醇溶液體外透瘢痕成纖維細胞CLSM熒光分布圖片（88×）Fig.2CLSM images of intracellular fluorescence in scar fibroblasts following delivery of RhoB labeled carrier in vitro(88×)

圖3 Rho醇脂體和Rho水醇溶液透細胞1～8 h后，細胞內單位面積光密度值Fig.3The intracellular OD value of unite area at different incubation time in RhoB labled ethosomal suspensions and RhoB labled hydroalcoholic solution

圖4 不同濃度5-FU醇脂體和5-FU水醇溶液對瘢痕成纖維細胞生長的影響Fig.4The effect of different concentrations of 5-FU ES and 5-FU HA on the growth of Fibroblasts

圖5 5-FU醇脂體和空白醇溶液對瘢痕成纖維細胞的影響（*：與ES比較P＜0.05）Fig.5 The effect of 5-FU ES and ES on the growth of scar fibroblasts(*:P＜0.05,compared to ES)

3 討論

5-FU是一種具有抗代謝活性的胸腺嘧啶類似物，已被證實是一種較好的抗瘢痕藥物[15]。醇脂體是一種新型脂質囊泡透皮載體，由Touitou等[12-13]在2000年首次提出。醇脂體囊泡的高度變形能力使其在透皮過程中能通過比自身粒徑小的空隙，從而攜帶活性藥物到達皮膚的深層，進而發揮藥理學作用[16]。因此，利用醇脂體將抗瘢痕藥物經皮遞送至瘢痕組織，將為瘢痕治療提供一種新的方便安全的給藥方式。我們前期的研究表明，粒徑在納米尺度范圍的醇脂體可有效攜帶5-FU進入瘢痕組織，并表現了較高的藥物滯留量，證明醇脂體是一種有效的透瘢痕藥物載體[9-11]。

細胞膜為半透膜，僅允許特定的分子透過，而阻止其他分子進入細胞，尤其是水溶性分子[17]，5-FU不能自由通過細胞膜。因此，當載5-FU醇脂體滲透角質層進入皮膚深層后，醇脂體能否進一步促進5-FU進入成纖維細胞發揮抑制作用尚不明確。

為了檢測醇脂體能否促進水溶性分子的細胞內遞送能力，本實驗采用水溶性熒光素標記醇脂體，作用于體外培養的人體增生性瘢痕成纖維細胞，觀察醇脂體能否促進熒光分子進入細胞內[18]。結果顯示，醇脂體可快速高效地將熒光素分子遞送至細胞內。脂質體粒徑在50～100 nm范圍內與細胞的相互作用方式主要是“內吞”作用[17]，本研究中的醇脂體粒徑在該范圍內，我們推測醇脂體組細胞內熒光強度明顯增加，可能是由于包封在醇脂體內的水溶性分子通過細胞對載藥醇脂體的“內吞”大量進入細胞內產生的。該結果提示，當載藥醇脂體滲透角質層進入皮膚深層后，醇脂體和活性藥物可能經此途徑進入細胞而發揮作用。

體外細胞活性實驗結果顯示，成纖維細胞的活性隨著5-FU濃度的加大而衰減，即存在明顯的劑量依賴性。5-FU濃度在5～20 μg/mL范圍內，對成纖維細胞的抑制作用最為明顯。而醇脂體本身對體外培養的成纖維細胞的生長無明顯抑制作用，說明5-FU醇脂體細胞活性的抑制作用是由5-FU產生的。因此，體外培養的細胞實驗中對成纖維細胞的生長活性起決定性作用的是5-FU，且相同5-FU濃度下，5-FU醇脂體對瘢痕成纖維細胞的抑制作用較水醇溶液明顯增強。結合體外透細胞實驗結果分析，原因可能為醇脂體通過將更多的5-FU遞送至細胞內而發揮針對成纖維細胞的抑制作用。

4 結論

本研究表明，醇脂體能夠促進水溶性藥物5-FU通過細胞膜屏障進入瘢痕成纖維細胞內，提高對成纖維細胞的抑制作用。本文雖未完整闡述醇脂體與瘢痕成纖維細胞的相互作用機制，但為醇脂體作為藥物載體在瘢痕治療中的應用，提供了實驗依據。

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Inhibitory Effects of Ethosomes Encapsulated with 5-Fluorouracil on Human Hypertrophic Scar Fibroblasts

ZHANG Zheng,WO Yan,ZHAGN Zhen,MAO Xiaohui,SU Weijie,PU Zheming,ZHANG Yan,ZHANG Yixin.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Yixin(E-mail:zhangyixin6688@163.com).

ObjectiveTo establish ethosomes encapsulated with 5-Fluorouracil and to explore the inhibitory effects of 5-FU on human hypertrophic scar fibroblasts.MethodsEthosomes encapsulated with 5-Fluorouracil was prepared by Touitou method and was evaluated.Human hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro,the penetration of the fluorescent probes into fibroblasts was examined by CLSM,and hydroalcoholic solution was set as control group.The effect of ethosomes encapsulating different concentration of 5-FU on fibroblast viability was tested by cell counting kit-8(CCK-8),and the median inhibitory concentration(IC50)was calculated.The effect of ethosomes on fibroblast viability was tested by CCK-8.ResultsThe particle size of 5-FU encapsulated ethosomes was(87.5±5.4)nm,the polydispersion index was 0.151±0.27, and the encapsulation efficiency of 5-FU was(10.03±2.12)%.CLSM micrographs showed that ethosomes facilitated the penetration of RhoB into the cell,as evident from the high intensity fluorescence.In comparison,when incorporated in hydroalcoholic solution,very weak fluorescence was detected.The optical density(OD)of unit area was calculated through the Image-Pro Plus 6.0 image analysis software,and the OD value of ethosomal group was distinguished higher than hydroalcoholic group(P<0.01).With the increase of the concentration of 5-FU,growth inhibition rate of fibroblast affected by 5-FU HA and 5-FU ES was gradually enhanced.The IC50 of 5-FU encapsulated ethosomes and 5-FU hydroalcoholic solution to fibroblasts were(9.2582±1.2329)μg/mL and(18.0352±2.3145)μg/mL,respectively,the difference between the two groups was distinguished(P<0.05).Meanwhile,ethosomal carrier was not toxic to the cultured cells.ConclusionEthosomes can effectively enhance intracellular delivery of 5-FU,as a result can enhance the inhibitory effect of 5-FU on fibroblast viability.Meanwhile,ethosomal carrier was not toxic to the cultured cells.Ethosomes as percutaneous drug delivery carriers,are also a promising candidate for the delivery of biological and chemical compounds to cultured cells.

Ethosomes;5-fluorouracil;Hypertrophic scar;Fibroblast;Intracellular delivery

R619+.6

A

1673－0364（2014）02－0077－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.004

國家自然科學基金（81071569）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

章一新（E-mail：zhangyixin6688@163.com）。