PML/RARα融合基因不典型FISH信號模式的APL的實驗與臨床特征研究

劉淑媛,欒樹清,聞芳,簡正偉,萬臘根,張長林

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

PML/RARα融合基因不典型FISH信號模式的APL的實驗與臨床特征研究

劉淑媛,欒樹清,聞芳,簡正偉,萬臘根,張長林

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

目的探討伴有PML/RARα不典型FISH信號模式的急性早幼粒細胞白血病的臨床和實驗室特征。方法采用PML/RARα的DCDF-FISH技術、染色體核型分析及FLT3-ITD突變檢測技術對初診的52例急性早幼粒細胞白血病患者骨髓標本進行檢測，比較FISH信號模式與其他檢測結果的關系。結果在檢測的52例標本中，51例存在PML/RARα融合基因，陽性率高達98.1%；51例FISH陽性患者中38例為典型的1R1G2F信號，13例呈不典型信號模式，其中2例為1R1G1F，3例為1R1G3F，6例為2R2G1F，1例為1R2G1F，1例為2R1G1F。將不典型FISH信號模式組和典型FISH信號模式組進行比較，我們發現不典型組的高白患者比率較典型組高(P>0.05)；且不典型FISH信號模式組中復雜核型與FLT3-ITD突變的發生率明顯高于典型信號組(P<0.05)。結論具有不典型FISH信號模式的APL患者常伴有復雜核型，FLT3-ITD突變等預后不良的指標，其具體作用方式仍有待進一步探討。

急性早幼粒細胞白血病；不典型FISH信號模式；FLT3-ITD突變；復雜核型異常

急性早幼粒細胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是一種以早幼粒細胞分化受阻為主要特征的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)。研究表明，90%以上的APL患者的白血病細胞中均存在非隨機染色體易位t(15;17)(q22;q21)，該易位使得17號染色體上的維甲酸受體(retinoic acid receptor，RARα)基因與位于15號染色體上的PML(Promylocytic leukemia)基因發生融合，形成PML-RARα融合基因，并編碼相應的融合蛋白[1]。PML-RARα融合蛋白以“顯性負調控”的方式抑制野生型PML和RARα的功能，導致骨髓粒細胞分化受阻，被認為是APL發病的關鍵因素[1，2]。而全反式維甲酸(ATRA)等藥物可以靶向PML/RARα蛋白降解，并誘導APL細胞分化，使得APL成為一個可以治愈的腫瘤[3]。因此，t(15;17)相關融合基因PML/RARα的檢測對APL的診斷、預后評估、個體化治療具有重要的價值。

目前，用于檢測PML/RARα融合基因的方法主要有染色體顯帶分析、逆轉錄-PCR方法和熒光原位雜交方法(FISH)等[4-6]。FISH特別是雙色雙融合熒光原位雜交技術(DCDF-FISH)，作為一種具有靈敏度高、特異性強、不受細胞周期限制的分子生物學技術，已經廣泛運用于臨床。采用DCDF-FISH技術檢測PML/RARα融合基因時，典型的信號模式為一紅一綠兩融合(1R1G2F)。當出現變異性和復雜性t(15;17)易位時，FISH的信號模式可能發生改變。因此研究不同的DCDF-FISH信號模式對APL疾病的進展、治療以及預后的影響，具有非常重要的意義。本研究采用DCDF-FISH技術對52例初診的APL進行PML/RARα融合基因檢測，發現13例具有不典型FISH信號模式，并通過細胞遺傳學、形態學、分子生物學等的聯合分析，并對其臨床及實驗室特征進行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床病例初診的52例APL患者均來自2010年至2012年南昌大學第一附屬醫院血液科，所有患者均根據WHO診斷標準，經形態學、細胞遺傳學、免疫學及分子生物學綜合檢測確診為APL，其中男性患者29例，女性患者23例，中位年齡為35歲(9～61歲)。

1.2 方法

1.2.1 常規細胞遺傳學分析治療前抽取骨髓標本2ml，有核細胞計數后按(1～2)×106/ml進行直接法或短期培養法制備染色體，并采用G顯帶技術進行核型分析，分析20個分裂相細胞。染色體核型按照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2005)》的有關規定加以識別和描述。

1.2.2 FISH分析檢測PML/RARα融合基因的雙色雙融探針購自美國Vysis公司，探針應用SpectrumOrangeTM標記PML基因、SpectrumGreenTM標記RARα基因。FISH操作步驟包括：滴片、變性、雜交、洗滌、復染以及熒光顯微鏡觀察間期細胞和分裂期細胞雜交信號。

1.2.3 FLT3-ITD突變檢測抽取患者骨髓標本2ml，采用上海飛捷生物公司試劑盒提取細胞DNA。針對FLT3基因設計引物，正義鏈：5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’；反義鏈：5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’。PCR反應體系10μl，反應條件為：95℃預變性5min后，95℃變性20s，52℃退火20s，72℃延伸20s，30個循環，最后72℃延伸7min，反應產物4℃保存。取PCR產物于3%瓊脂糖凝膠，1×TAE液中電泳20min，用紫外光透視儀分析圖像并照相。野生型擴增產物為329bp處出現單一峰，ITD突變型擴增產物為在大于329bp處出現的特異性條帶。

1.2.4 統計學分析由于存在標本理論頻數＜5，采用Fisher精確概率法進行統計分析，以P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 DCDF-FISH檢測PML/RARα融合基因常見信號模式采用DCDF-FISH檢測PML/RARα時，正常細胞信號模式為2紅2綠(2R2G)模式(圖1a)。在典型的t(15;17)易位的細胞中，可見1紅1綠2融合(1R1G2F)信號模式，其中1紅1綠分別是正常的PML和正常的RARα基因，2個融合信號分別PML/RARα和RARα/PML信號(圖1b)。除1R1G2F信號模式(典型信號模式)，我們在實驗診斷中還發現5種信號模式，分被為1R1G1F，1R1G3F，2R2G1F，1R2G1F，2R1G1F(圖1c-g)。

圖1 DCDF-FISH方法檢測PML/RARα融合基因的信號模式

已進行FISH檢測的52例初診APL患者中，51例患者存在融合信號，陽性率為98.1%，其中的38例為1R1G2F信號模式；13例出現不典型信號模式，其中2例為1R1G1F，3例為1R1G3F并伴有1R1G2F，6例為2R2G1F，1例為1R2G1F，1例為2R1G1F(表1、圖2、圖3)。

2.2 FISH信號模式與染色體核型關系在52例APL患者中，46例進行了常規細胞遺傳學分析，其中存在t(15;17)易位的患者27例，15例患者為正常核型，4例患者無分裂象，陽性率為58.7%。在13例含不典型信號模式的標本中，12例進行了核型分析，結果顯示6例為復雜異常核型，占46.2%，其中4例為伴t(15;17)(q22;q21)易位的復雜核型異常；2例為單純的t(15;17)(q22;q21)；正常核型3例；未見分裂象1例。38例典型信號模式組中，34例進行了核型分析，其中1例存在t(15;17)(q22;q21)，并伴1q-、7q+、+r等復雜結構異常，占2.63%；另有18例為單純的t(15;17)(q22;q21)；正常核型12例；未見分裂象3例。不典型FISH信號模式組中復雜核型比例較典型信號組高，且兩者差異顯著(P=0.0006)。

表1 13例具有不典型FISH信號模式的APL患者實驗室檢測結果

注：a為7號患者易位模式；b為5號患者易位模式圖2 2R2G1F和1R1G3F信號模式的染色體分析

注：a箭頭顯示異常的紅色信號和融合信號；b箭頭顯示異常的綠信號和融合信號圖3 2R1G1F和1R2G1F的FISH信號模式

2.3 初診WBC計數與不典型PML/RARα的FISH信號關系13例具有不典型FISH信號模式的APL患者初診外周血白細胞計數為16.52(0.7～60.19)×109/L，其中高白細胞(＞10×109/L)患者6例，所占比46.16%；而38例具有典型FISH信號模式的APL患者初診WBC為12.05(0.5～75.8)×109/L，其中高白細胞患者11例，占28.9%。具有不典型FISH信號模式的患者中高白細胞患者較典型FISH信號模式組多，但兩者無統計學差異顯著性(P＞0.05)。

2.4 FLT3-ITD基因突變與不典型PML/RARα的FISH信號關系52例APL患者中，有47例進行了FLT3-ITD突變檢測，7例FLT3-ITD突變陽性，陽性率為14.9%。13例不典型FISH信號模式的APL患者中有6例進行了FLT3-ITD突變檢測，4例陽性，陽性率為66.7%；而進行突變檢測的38例典型信號模式組3例發現FLT3-ITD突變，突變率為7.89%，明顯低于前者，具有統計學意義(P= 0.0026)。

3 討論

APL是AML中一個比較特殊的亞型，約占所有AML的10%，并且具有特異的形態學特征及細胞分子遺傳學特征；此病起源于髓系早幼粒細胞，由于其腫瘤細胞中存在較多的促凝顆粒，臨床上多伴發彌散性微血管凝血，易導致APL患者的早期死亡。目前，對于APL患者的初始治療多采用聯合維甲酸/亞砷酸及蒽環類藥物進行誘導分化治療，以降低患者死亡率，延長患者生存壽命[3]。研究發現，90%以上的APL患者具有特征性的t(15;17)(q22;q21)染色體易位形成的PML-RARα融合基因[1]。本研究中，通過對52例APL患者進行檢測，DCDF-FISH法檢測PML-RARα融合基因的陽性率高達98.1%，而常規遺傳學核型分析t(15;17) (q22;q21)陽性率僅為54.3%，表明DCDF-FISH檢測PML-RARα融合基因敏感度高，對診斷APL具有決定性意義。

采用DCDF-FISH技術檢測PML/RARα時，典型的易位t(15；17)易位形成的兩條衍生的染色體der(15)和der(17)都有融合信號(圖1b)，但是由于在易位過程中會發生部分缺失、擴展或涉及到3條以上的染色體，FISH信號模式就會發生改變。在本研究中，我們發現13例患者的FISH結果呈不典型信號模式，占總體的25.5%。其中以2R2G1F(6例)和1R1G3F(3例)信號模式為主，通過染色體分析發現，2R2G1F信號模式為三條染色體循環易位(圖2a模式)，如7號患者易位方式為6p21-qter易位到17q22；17(17q21-q22)易位到15q22；15q22-qter易位到6p21(圖2a)。1R1G3F由ider(17)(q10)t (15;17)產生，如5號患者中兩個融合信號時由于衍生的17號染色體發生長臂等臂導致(圖2b)。此外，我們還發現兩例隱形易位的患者，這兩位患者染色體核型為正常核型，DCDF-FISH可以看見一個非常細小的熒光信號(圖3a-b示)，很容易作為非特異性信號，容易造成假陰性結果。最近，Campbell LJ等總結了10例這樣的病例，發現采用Vysis公司SF探針(single fusion probe)和分離探針(break apart probe)都不能檢測到融合信號，采用Vysis公司的DF探針(dual fusion probe)檢測到3例陽性患者(3/10)，而采用Cytocell公司的DF探針以及ES探針檢測陽性率為100%[7]。通過進一步分析Campbell LJ等發現該信號模式為小片段的PML或RARα插入導致，由于Vysis公司探針過長，不易與小片段雜交，從而導致陰性的出現，而Cytocell公司探針相對比Vysis公司小的多，容易與小片段雜交，因此可以檢測到小片段的異常。因此，在選擇FISH探針時要選擇大小適中的探針，探針太小容易出現非特異信號，容易造成假陽性，而探針太大有可能會出現假陰性。

大量研究結果表明具有單純的t(15;17)(q22; q21)的APL患者對ATRA敏感，CR(complete remission)率高(可達90%)，無病生存率高，五年生存率可達到80%，預后好。但是，除t(15;17)(q22;q21)外，還伴有一些其他染色體異常(additional chromosome abnormalities，ACAs)或者FLT3-ITD突變的患者[8-11]，對ATRA反應性差，無病生存率和五年生存率明顯低于低于單純性t(15;17)(q22;q21)的患者。本研究中發現通過核型分析我們發現在38例具有典型FISH信號模式的APL患者中有1例伴有復雜核型；而13例具有不典型FISH信號模式的APL患者中有6例具有復雜核型；兩者差異有顯著性(P<0.05)。另外，在我們的研究中還發現含有不典型FISH信號模式的患者FLT3-ITD突變明顯高于典型信號模式的患者，表明具有不典型FISH信號模式的患者存在更為復雜的遺傳學異常，提示不典型信號模式的患者相對典型信號患者預后要差。

APL初始白細胞數也是評價APL患者預后的一個指標。多項研究發現，當APL初始白細胞數大于10×109/L時，患者無病生成率和總生存率都明顯低于初始白細胞數低于10×109/L的患者[12]。在本研究的52例患者中，具有不典型信號模式的患者中白細胞數大于10×109/L的患者(46.16%)比典型信號模式的患者(28.9%)多(P=0.256)，雖然兩者無顯著的統計學意義，但也能提示不典型信號模式的患者預后更差可能。

以上結果表明，具有不典型FISH信號模式的APL患者常伴有ACAs，FLT3-ITD以及高白細胞血癥等預后差的指標。

[1]Biondi A,Rambaldi A,Alcalay M,et al.RAR-alpha gene rearrangements as a genetic marker for diagnosis and monitoring in acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1991,77(7):1418-1422.

[2]Melnick A,Licht JD.Deconstructing a disease:RARalpha,its fusion partners,and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1999,93(10):3167-215.

[3]Wang ZY,Chen Z.Acute promyelocytic leukemia:from highly fatal to highly curable[J].Blood,2008,111(5):2505-2515.

[4]王蓉,繆扣榮,仇海榮,等.間期熒光原位雜交和常規染色體分析診斷急性早幼粒細胞白血病的比較[J].中國實驗血液學雜志, 2011,19(4):983-986.

[5]Lewis C,Patel V,Abhyankar S,et al.Microgranular variant of acutepromyelocyticleukemiawithnormalconventional cytogenetics,negative PML/RARA FISH and positive PML/RARA transcripts by RT-PCR[J].Cancer Genet,2011,204(9):522-523.

[6]江梅,萬臘根.RQ-PCR技術檢測白血病融合基因及其臨床應用[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(5):469-472.

[7]Campbell LJ,Oei P,Brookwell R,Shortt J,et al.FISH detection of PML-RARA fusion in ins(15;17)acute promyelocytic leukaemia depends on probe size[J].Biomed Res Int,2013,2013:164501.

[8]KaleemZ,WatsonMS,ZutterMM,etal.Acutepromyelocytic leukemia with additional chromosomal abnormalities and absence of Auer rods[J].Am J Clin Pathol,1999,112(1):113-118.

[9]馬力,李建勇,潘金蘭,等.伴有復雜核型的急性早幼粒細胞白血病的臨床及實驗研究[J].現代腫瘤醫學,2010,18(3)：0552-0554.

[10]Thiede C,Steudel C,Mohr B,et al.Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis[J].Blood,2002,99(12):4326-4335.

[11]Gallagher RE,Moser BK,Racevskis J,et al.Treatment-influenced associations of PML-RARα mutations,FLT3 mutations,and additional chromosome abnormalities in relapsed acute promyelocytic leukemia[J].Blood,2012,120(10):2098-108.

[12]Fenaux P,Chastang C,Chevret S,et a1.A randomized comparison of all transretinoic acid(ATRA)followed by chemotherapy and ATRA plus chemotherapy and the role of maintenance therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1999,94(4): 1192-1200.

The clinical and laboratory research of thirteen acute promyelocytic leukemia patients with atypical signal modes in FISH detection of PML/RARα fusion

LIU Shuyuan,LUAN Shuqing,WEN Fang,et al.

The Clinical Laboratory of the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To explore the clinical and laboratory characteristics of acute promyelocytic leukemia with atypical signal modes in FISH detection of PML/RARα fusion.Methods Bone marrow samples from 52 patients with newly diagnosed acute promyelocytic leukemia were detected with DCDF-FISH for PML/RARα,karyotype analysis and PCR for gene mutation of FLT3-ITD.The relations between signal modes of DCDF-FISH and other test results were analyzed.Results PML/RARα fusion was identified in 51(98.1%)among 52 patients.We found that 38 cases had a typical signal mode(1R1G2F)and 13 cases had atypical signal modes including 2 1R1G1F,3 1R1G3F,6 2R2G1F,1 1R2G1F,1 2R1G1F.Comparing the clinical and laboratory characteristics of these two groups,we found that a high WBC was more prevalent in patients with atypical FISH signal modes(P> 0.05),and the atypical FISH signal modes were associated with higher percentage of complex chromosome abnormalities and FLT3-ITD(P<0.05).Conclusion APL patients with atypical FISH signal modes are often accompanied by some poor prognostic indicators such as complex chromosome abnormality and FLT3-ITD mutation，but the mechanism needs to be further discussed.

APL;Atypical FISH signal mode;FLT3-ITD mutation;Complex chromosome abnormality

R733.7

A

1674-1129(2014)04-0374-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.004

2014-03-17；

2014-07-03)

江西省自然科學基金項目(編號：20122BAB205025)作者簡介：劉淑媛，女，出生于1989年4月，南昌大學2012級臨床檢驗診斷學碩士研究生，研究方向：白血病的分子診斷。通信作者：張長林，男，出生于1984年8月，畢業于上海交通大學，碩士學位，中級職稱，研究方向：白血病的分子診斷。