乳酸乳球菌Nisin抗性基因的異源性表達和活性研究

楊潔，賀松

(成都大學附屬醫院,四川成都610081)

乳酸乳球菌Nisin抗性基因的異源性表達和活性研究

楊潔，賀松

(成都大學附屬醫院,四川成都610081)

目的評估乳酸乳球菌Nisin抗性基因在德氏乳桿菌保加利亞亞種的表達活性，為建立食品級篩選標記做準備。方法將新鮮牛奶接種于含有400μg/ml乳酸鏈球菌素的M17平板上，在分離的菌株中篩選乳酸乳球菌，同時提取其基因組DNA和質粒DNA，根據已公布的Nisin抗性基因序列設計一對引物，以提取的基因組DNA和質粒DNA為模板進行PCR擴增，產物進行電泳分析。將目的基因插入到大腸桿菌乳桿菌穿梭質?！猵MG36e中，并在德式乳桿菌保加利亞亞種中觀察目的基因的表達活性及其作為篩選標記的活性。結果成功篩選出對Nisin具有抗性的乳酸乳球菌，進行目的基因擴增后成功將目的基因轉化到L6032中，并表達出Nisin抗性。結論在德式乳桿菌保加利亞亞種中成功克隆及表達出Nisin抗性基因。

乳酸乳球菌；德式乳桿菌保加利亞亞種；Nisin抗性基因；食品級篩選標記

乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸鏈球菌產生的一種多肽物質，由34個氨基酸殘基組成[1]。食用后在人體的生理PH條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變人體腸道內正常菌群以及產生如其它抗菌素所出現的抗性問題，更不會與其它抗菌素出現交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑[2,3]，在全球48個國家合法使用[4]。乳酸鏈球菌素(Nisin)能有效抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細菌[5,6]，如乳桿菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌[7,8]等，特別是對產芽孢的細菌如芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌有很強的抑制作用[4]。通常，產芽孢的細菌耐熱性很強，如鮮乳采用135℃、2s超高溫瞬時滅菌，非芽孢細菌的死亡率為100%，芽孢細菌的死亡率90%，還有10%的芽孢細菌不能殺滅。若鮮乳中添加0.03～0.05g/kg Nisin就可抑制芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌孢子的發芽和繁殖。Nisin的抑菌機制為：吸附于敏感菌的細胞膜上，其C末端侵入膜內形成通透孔道，允許分子量小于0.5kDa的親水分子流入，而導致細胞膜去極化及ATP的泄漏，細胞自溶而死亡[9,10]。乳酸乳球菌的Nisin抗性基因通常來源于兩個因素：對于能產Nisin抗性基因的乳酸乳球菌菌株，NisI基因在Nisin免疫中有重要的作用[11,12]；對于非產Nisin抗性基因的乳酸乳球菌，能編碼Nisin抗性序列[13]。

無論何種類型的載體都必須帶有一個有效的篩選標記確保轉化子的篩選。傳統的乳酸菌載體都帶有一個或多個編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素等)的異源性基因，這為遺傳操作保持了一定的選擇壓力，是有效的重組子篩選方法。但是如果將帶有抗生素抗性基因的菌株投放到環境或人和動物體內，由于抗性基因有轉移的可能，將會帶來嚴重生物安全隱患，因此在實際生產中也必然受到限制。最有效的方法是使用對人體安全的食品級篩選標記來構建載體。目前國內外已有許多關于食品級篩選標記研究的報道，包括細菌素抗性及免疫性標記、重金屬抗性標記、噬菌體抗性標記、營養缺陷互補標記和糖類利用篩選標記。

在本次研究中，從新鮮牛奶中分離出帶有Nisin抗性基因的乳酸乳球菌，然后將Nisin抗性基因克隆到德式乳桿菌保加利亞亞種中，研究其中的轉化成功菌株的Nisin抗性基因活性。

1 材料與方法

1.1 標本來源Nisin從Sigma公司購買，質粒PMG36e由荷蘭University of Groningen Jan.Kok教授惠贈。大腸桿菌DH5α菌株常規培養于37℃LB培養基中[14]。作為Nisin抗性基因敏感的表達宿主德式乳桿菌保加利亞亞種在37℃MRS培養基[15]中培養。

1.2 儀器與試劑細菌基因組提取試劑盒(Promega)、質粒抽提試劑盒(Promega)、紫外分光光度計

1.3 實驗方法將從農場獲得的新鮮牛奶接種于含有400μg/ml乳酸鏈球菌素的M17肉湯中[16]，在30℃條件下培養16h，然后將50ul菌懸夜接種于含有400μg/ml乳酸鏈球菌素的M17瓊脂平板上，在30℃條件下培養24h。將篩選出的單克隆菌株按照上述方法再次培養。然后對篩選出的細菌進行革蘭染色、形態學、觸酶試驗進行初步篩選，選擇觸酶陰性的革蘭陽性球菌，用乳酸乳球菌16S rDNA通用引物(F-5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R-5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’[17])擴增，反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性30s、58℃退火40s、72℃延伸90s進行30個循環，72℃延伸10min。將擴增的產物送Invitrogen公司測序，測序結果用Blast軟件進行在線比對。

分別利用細菌基因組提取試劑盒(Promega)和質粒抽提試劑盒(Promega)提取陽性篩選菌株的基因組DNA和質粒DNA。DNA的含量與純度利用紫外分光光度計在260nm和280nm處測定，將其保存于4℃條件下。

根據GenBank公布的Nisin抗性基因序列(No: M37002)，設計一對引物:F-5’-AAAACTGCAGGCCATGACTTGATACCCGAT-3,R-5’-CCCAAGCTTGCATTGGTACTTGCTTTCGG-3’(分別在上游引物引進限制性核酸內切酶Pst I，下游引物引進限制性核酸內切酶Hind III，見下劃線處)，擴增產物長度為1406bp，包括Nisin抗性基因開放閱讀框和啟動子。以之前提取的基因組DNA和質粒DNA作為模板進行擴增，反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性40s、55℃退火40s、72℃延伸90s進行35個循環，72℃延伸10min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。用QIAGEN公司的DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化，純化產物用Pst I和Hind III進行雙酶切，酶切產物與選擇相同的限制性核酸內切酶酶切的質粒PMG36e進行連接,連接產物命名為pMG36e-nsr。pMG36e-nsr轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并接種于含有150μg/ml紅霉素的LB高滲肉湯中，在37℃條件下振蕩培養2h，取50μl培養液涂布接種于含有150μg/ml紅霉素的LB平板，在37℃培養18h。挑取單克隆菌落，采用酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定(由Invitrogen公司完成)。

用質粒抽提試劑盒提取重組質粒pMG36ensr，電穿孔轉化德式乳桿菌保加利亞亞種(L6032)，轉化條件為1.9Kv，2.8ms。將轉化后的細菌接種在含有200g/L蔗糖的MRS高滲液體培養基，37℃培養3h。將細菌培養液接種于含有10 μg/ml紅霉素的MRS平板，在37℃培養3d。陽性轉化菌株命名為L6032-nsr，分別接種于含有不同濃度乳酸鏈球菌素(0 μg/ml,100 μg/ml,200 μg/ml,300 μg/ml, 400 μg/ml)的MRS肉湯，37℃培養48h，在同樣條件下培養L6032和L6032-PMG36e作陰性對照，每三個小時測量菌液在600nm處的吸光度值，并描繪出生長曲線。同時在含有10μg/ml紅霉素的MRS肉湯中培養L6032-nsr，作為對照分析Nisin抗性基因表達活性。

2 結果

2.1 Nisin抗性菌株的分離與鑒定最終分離出6株有Nisin抗性的菌株。這些分離出的6中菌株通過形態學、生化鑒定和16S rDNA測序鑒定均為乳酸乳球菌，分別命名為L-no1、L-no2、L-no3、L-no4、L-no5、L-no6。

2.2 Nisin抗性基因的克隆以從上述6株單克隆菌株提取的基因組DNA和質粒DNA為模板進行PCR擴增，目的基因片段從L-no2的基因組DNA中獲得。將目的基因片段純化后利用限制性內切酶進行雙酶切，轉入質粒pMG36e中，命名為pMG36e-nsr。通過酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定證實重組質粒構建成功。基因序列中包含開放閱讀框(957 bp)和上游的轉錄調控位點。我們將克隆基因與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites)公布的nsr基因進行同源性分析，利用歐洲分子生物學實驗室提供的ClustalW2軟件進行序列比對，分析結果見表1和圖1。從圖1和表1看出，我們擴增的序列與公布的乳酸乳球菌質粒pND301 (U25181)相似性為95%、與乳酸乳球菌(M37002)相似性為88%、與乳酸乳球菌克隆菌株TS1640 (AY219902)相似性為87%、與乳酸乳球菌K21-1 (EU747092)相似性為85%。

2.3 nsr基因的活性表達利用電轉化將重組質粒pMG36e-nsr轉入德式乳桿菌保加利亞亞種(L6032)中，陽性轉化菌株(L6032-nsr)分別接種于含有不同濃度乳酸鏈球菌素(0 μg/ml,100 μg/ml, 200 μg/ml,300 μg/ml,400 μg/ml)的MRS肉湯，描繪出在600nm處的生長曲線(見圖2)。從圖2中可看出，不含有乳酸鏈球菌素的肉湯中L6032-nsr, L6032和L6032-pGM36e均生長良好,6h后達到對數生長，24h后進入平臺期。但是在含有100 μg/ml的乳酸鏈球菌素的肉湯中L6032和L6032-pGM36e在第一個24h幾乎不生長，24h后，由于乳酸鏈球菌素活性的降低，這兩種菌株開始生長。因為L6032-nsr具有Nisin抗性，它的生長完全不受乳酸鏈球菌素的影響，在五個MRS肉湯中均生長良好。同時，為了驗證nsr基因作為食品級篩選標記的活性，我們將其與紅霉素抗性基因(Emr)作對比。我們將L6032-nsr分別接種于含有400 μg/ml的乳酸鏈球菌素和10 μg/ml的紅霉素MRS肉湯中，測定它們在600nm出的生長曲線(見圖2)。從圖中可看出，兩個生長曲線幾乎是一樣，如此可以說明，我們可以用nsr基因替代Emr作為一種食品級篩選標記。

表1 本次研究的nsr基因序列與網上公布的序列同源性比對得分

注：Nsr-L-no2為Nisin抗性基因包括了開放閱讀框和啟動子。圖1 nsr基因序列與公布的序列比對的系統樹圖

3 討論

圖2 德式乳桿菌保加利亞亞種在含有不同濃度Nisin的MRS培養基中的生長曲線

將新鮮牛奶接種于含有400 μg/ml高濃度的乳酸鏈球菌素的M17平板上，我們最終分離出6株帶有Nisin抗性的乳酸乳球菌，通過一系列的鑒定，只在其中一株中發現了nsr基因。其余五種菌株對Nisin的抗性可能是產Nisin的乳酸乳球菌,或者與網上公布的M37002的核酸序列有較大差異。

乳酸菌被大量應用于酸奶和奶酪的生產中，由于這種大量的商業運用，開展了大量的基礎與應用研究來更好地了解乳酸菌[18-20]，力求找出更好的菌種或者通過基因優化的方式改善菌種，這類菌株應該適合實驗室和工廠應用。由于乳酸菌應用的特殊性，這就要求其載體系統必須具有十分安全的特性。采用的選擇標記、染色體組成型或控制基因表達范圍，都必須滿足食品級載體系統的三個基本條件。表達宿主菌必須是安全的、特征清楚且穩定的食品級微生物，如：乳酸乳球菌、乳酸桿菌及其他已在食品工業中得到長期而廣泛應用的菌株；誘導物必須是食品級的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、Nisin等可被人食用或對人體無害的物質，或溫度、酸誘導等對人體無害的條件；載體必須是食品級的，不能有非食品級的功能性DNA存在，與食品級表達系統有關DNA必須來源于食品級(GRAS)微生物。

乳酸菌能夠攜帶的質粒具有很多能工業化的特性，包括乳糖利用、生產細菌、噬菌體抗性、胞外多糖生產[21-23]。許多方法已經被設計運用于乳酸菌的染色體突變，但是乳酸菌的質粒攜帶基因工程在食品級方面的應用存在著巨大的潛在利用，這一方面目前還很少被涉及到。有效的質?；蚬こ炭梢匀コ蛘咛鎿Q不良基因，進行特定的質粒基因的功能分析，還能引入基因的點突變決定個別核苷酸和氨基酸的重要性。除了與食品級質粒基因工程相關的局限性，缺乏一個現有的可選擇標記完成轉錄也使其應用受到限制。由于抗生素選擇標記在食品級的應用限制，三種替代方式已被使用。第一種是顯性標記，包括了細菌素抗性和免疫性標記[24]、重金屬抗性標記，這類標記比較直觀，但是依賴于目的質粒上的篩選標記的存在。第二種選擇標記是營養互補型標記，比如胸苷酸互補型、氨基酸互補型，這種方法是需要有相應的基因缺陷型菌株，然后在表達質粒中加入該表型互補的序列。第三種是糖類利用篩選，比如乳糖利用[25]、蔗糖、木糖等等。

在本次研究中，我們將nsr基因克隆到質粒pMG36e中，形成重組質粒pMG36e-nsr,研究nsr基因在德式乳桿菌保加利亞亞種(L6032)的活性表達。研究證明L6032-nsr獲得了較強的Nisin抗性。與紅霉素抗性標記作對比，L6032-nsr仍然在只含有Nisin的MRS平板中生長良好。由此說明重組質粒在沒有紅霉素篩選壓力的情況下仍然沒有丟失?？梢?，將來nsr基因作為食品級篩選標記有較大潛力能夠代替抗生素篩選標記。

食品級篩選標記Nisin的篩選效能與紅霉素作為篩選標記相同，但是Nisin的傳代是否會丟失，還待進一步實驗研究。

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Heterologous expression and activity research of a nisin resistance gene in Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus

Objective To evaluate the activity of nisin resistance gene(nsr)in transformant Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,and prepare for establishing a food-grade selective marker.Methods Inoculated fresh milk in M17 broth containing 400μg/ml nisin and incubated at 30℃for 16 h.Then picked out the suspected colonies,and extracted genomic DNA and plasmid DNA.Based on the nsr gene sequence information,PCR amplification was performed with genomic DNA or plasmid DNA,electrophoretic analysis was used to analyze the products.The target gene was inserted into pMG36e,and recombinant plasmid pMG36e-nsr was transformed into Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(L6032)competent cells.Results Six nisin resistant stains were identified as Lactococcus lactis.The target gene was cloned into E.coli-Lactobacillus shuttle vector pMG36e.The Nisin resistibility was obtained when the recombinant plasmid pMG36e-nsr was transformed into Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus L6032 competent cells.Conclusions The nsr gene was successfully cloned and expressed in Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus L6032.

Lactococcus lactis；Lactobacillus delbrueckit subsp.bulgaricus;Nisin resistance gene(nsr)；Food-grade.

YANG Jie,HE Song.
The Affiliated Hospital of Chengdu University,Chengdu 610081，China.

2014-03-03；

2014-05-26)

楊潔，女，1989年3月出生，畢業于成都醫學院醫學檢驗系，檢驗師，研究方向為分子生物以及微生物檢驗。

Q786

A

1674-1129(2014)04-0381-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.006