南昌地區獻血者HBV感染隱匿風險與基因型調查分析

錢榕，方昌志，熊麗紅，楊莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·實驗研究·

南昌地區獻血者HBV感染隱匿風險與基因型調查分析

錢榕，方昌志，熊麗紅，楊莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的探討南昌地區獻血者乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染隱匿風險與HBV感染人群中HBV基因分型，為血液篩查策略、地區流行病學提供研究數據。方法(1)對2012年1月1日至2012年12月31日64 400份獻血者標本采用ELISA法進行HBsAg篩檢；(2)對HBsAg篩檢陰性標本進行HBV/HCV/HIV 3項聯合病毒核酸檢測(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)，再對NAT陽性標本進行HBV DNA定量及血清乙肝五項標志物檢測；(3)選取HBsAg篩查陽性標本200份和HBsAg篩查陰性而HBV DNA陽性標本30份，對所有HBV DNA陽性標本進行病毒核酸提取、擴增及測序分型，檢測HBV基因型。結果(1)64 400份獻血者標本中共檢出HBsAg陽性862份和陰性63538份；HBsAg檢測陰性標本通過NAT檢測，共檢出HBV DNA陽性84份，獻血者HBV感染率為1.47%，HBV輸血感染隱匿風險為0.13%；(2)獻血者HBV感染以隱匿型為主(75.0%，63/84)，其病毒載量多數＜20/ml(70.2%，59/84)；3)選取的200份HBsAg陽性標本中共檢出HBV DNA陽性118份，148份HBV DNA陽性標本有66份樣本分型成功，共檢出B基因型為47份(71.2%)，C基因型為19份(28.8%)，未檢出其它基因型。結論ELISA法篩查HBsAg陰性的獻血者中HBV感染隱匿風險依然存在，且多以低病毒載量的隱匿性感染為主，應對獻血者標本常規開展NAT檢測；南昌地區獻血者中HBV感染基因型以B型為主，C型次之，未見其它基因型。

獻血者；HBsAg；基因型；核酸檢測；風險

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染可致人體出現急性、慢性肝炎、肝硬化等疾病，能通過輸血傳播，屬血液傳播性疾病。我國對獻血者HBV感染篩查主要通過ELISA法檢測HBsAg，但由于病毒感染窗口期、隱匿性肝炎(Occult HBV Infection,OBI)、基因變異等因素的存在，少數HB-sAg篩查陰性的獻血者體內仍有存在一定程度HBV DNA復制的可能，ELISA法篩查HBsAg存在一定的局限性，因此，需要通過病毒核酸檢測技術(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)對獻血者樣本進行HBV DNA檢測來降低HBV輸血感染隱匿風險，提高輸血安全性[1-5]。本研究通過對2012年南昌地區獻血者標本的HBV感染檢測，分析了本地區獻血者HBV感染率及HBV輸血感染的隱匿風險，并探討了獻血者HBV感染基因型分布情況，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理本中心2012年1月1日至2012年12月31日HBsAg試紙快篩合格的無償獻血者64 400名，獻血后均留取血液標本3管：2管為帶分離膠EDTA抗凝真空采血管，每管血樣5 ml，其中1管用于NAT檢測，另1管用于HBV分型檢測；1管為EDTA抗凝真空采血管，血樣5 mL，用于HBsAg檢測；所有標本經3 000 g×15min離心后，HBV分型樣本置-20℃凍存，其余標本均保存于2～8℃冰箱。

1.2 儀器與試劑Hamilton Microlab Star全自動加樣儀(瑞士哈密頓公司)；XANTUS全自動加樣儀(深圳愛康電子有限公司)；FAME全自動酶免分析儀(瑞士哈密頓公司)；Cobas s201(瑞士羅氏公司)；AB3500XI測序儀(美國ABI公司)；HBsAg金標快篩試劑(廈門新創)，HBsAg ELISA檢測試劑(廈門新創和北京金豪)，核酸定性篩查試劑：Cobas TaqScreen MPX Test 1.0(瑞士羅氏診斷公司)；核酸定量檢測試劑：COBASRAmpliPrep/COBASRTaq-Man HBV Test2.0(瑞士羅氏診斷公司)；DNA提取試劑：QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)；所有試劑均在有效期內使用。

1.3 檢測流程

1.3.1 HBsAg試紙快篩檢測獻血者在獻血前采用金標快篩試劑進行HBsAg檢測，對金標法HBsAg檢測結果合格的獻血者，按要求采集和保存血液標本。

1.3.2 HBsAg ELISA檢測所有獻血者標本同時選用兩種不同廠家試劑采用ELISA法進行HBsAg檢測，對HBsAg篩檢陰性標本進行病毒核酸檢測。判定規則：每板設置陰性與弱陽性質控各一孔，室內質控在控則判定本批次實驗結果有效；酶免檢測S/CO≥1判為有反應性，S/CO值在0.8～1之間設置為灰區；雙試劑檢測均為S/CO≥0.8判定為不合格，如僅單試劑檢測S/CO≥0.8，采用同種試劑對該標本進行雙孔復檢，任1孔S/CO≥0.8判為不合格。

1.3.3 病毒核酸檢測采用Cobas TaqScreen MPX 1.0試劑對陰性血液標本進行HBV/HCV/HIV 3項NAT檢測，檢測模式為混樣檢測+拆分檢測，先將6份標本(167μl/份)匯集為1份混樣標本(1ml)，在Cobas s201血液核酸篩查平臺上進行檢測，如混樣檢測結果為陰性，則該6份標本NAT檢測陰性，如混樣檢測結果為陽性，則該6份標本進行單標本拆分檢測(1ml/份)，如單標本檢測結果為陰性，則該份標本3項NAT聯合檢測陰性，反之，則該單份標本3項聯合NAT檢測陽性。所有NAT陽性標本進行HBV DNA定量檢測，未檢出HBV DNA，則HBV DNA檢測陰性，反之，則HBV DNA檢測陽性。

1.3.4 血清乙肝標志物檢測HBV DNA陽性樣本采用Roche ELECSYS2010全自動免疫電化學發光分析儀配套試劑進行乙肝五項血清標志物檢測。

1.3.5 HBV測序分型(1)HBV DNA定量檢測：選取200份HBsAg陽性標本采用單人份檢測模式進行HBV DNA定量檢測：分別吸取650μl標本在COBASRAmpliPrep/COBASRTaqMan平臺上進行檢測，未檢出HBV DNA,則該標本HBV DNA陰性，檢出HBV DNA,則直接報HBV DNA定量結果。(2) HBV DNA陽性樣本序列分析用QIAamp DNA blood mini kit從HBV DNA陽性標本中提取HBV DNA，按試劑說明書操作，最后以50μl水溶解，A260/280值為1.8～2.1，通過分析比較GENBANK中已公布的已知基因型的HBV S區序列，根據其保守區域設計出4條引物(表1)，用于該序列的巢式PCR擴增。

反應體系:10×buffer2.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，dNTP0.8μl，Taq酶0.2μl，ddH2O 11.2μl，模板5.0μl。反應條件:95℃預變性2min、94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸3min，40個循環，72℃延伸10min。2輪PCR反應體系和反應條件相同。擴增產物鑒定:PCR結束后取產物5μl，經1.5%瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統觀察結果。用DL2000作為Marker判斷產物分子量大小。PCR擴增產物經切膠純化后用第2輪擴增引物作為測序引物做雙向測序。測序結果用ClustalⅩ與標準株比對，分析序列變異情況，用Mega 4.0軟件作進化樹分析，確定HBV基因型。

表1 HBV S區擴增引物

1.3.6 統計學分析用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗組間率的比較，P<0.05為差異具統計學意義。

2 結果

2.1 獻血者HBV感染情況64 400份HBsAg快篩合格獻血者標本中，ELISA法共檢出HBsAg陽性862份，陽性率為1.34%。63538份HBsAg篩查陰性樣本中共檢測出NAT陽性139份，其中HBV DNA陽性84份，獻血者HBV感染率為1.47%，HBV輸血感染隱匿風險率為0.13%；HBsAg篩查陰性樣本中HBV DNA以低病毒載量為主，定量結果多＜20IU/ml的(70.2%)(見表2)。

表2 84份HBV DNA陽性標本病毒載量

2.2 NAT陽性標本中HBV感染模式通過對84份HBV DNA陽性標本血清乙肝標志物檢測分析，共發現可疑窗口期感染6人份(占7.1%)，隱匿性感染63人份(占75.0%)、其他15人份(17.9%)，見表3。

2.3 獻血者中HBsAg陽性人群HBV DNA定量檢測隨機選取ELISA法檢測HBsAg陽性標本200人份，共檢出HBV DNA陽性118人份，陽性率為59.0%，其中定量結果顯示≤102IU/ml者占69.5%(82/118)。

HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb＜20≥20～＜102≥102人份(%)感染狀況HBV DNA定量/(IU/ml) -------+ + + ---+ + + --+ + ------+ -----+ --+ -+ -+ -+ + -+ + + + -+ 4 9 2 0 0 1 0 6 1 8 0 1 1 3 9 2 0 2 0 4 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 6(7.1) 12(14.3) 29(34.5) 2(2.4) 10(11.9) 9(10.7) 1(1.2) 12(14.3) 1(1.2) 2(2.4)可疑窗口期隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)

2.4 HBV基因分型148份HBV DNA陽性獻血者中有66例成功測序分型，檢出B基因型為47人份(71.2%，47/66)，C基因型為19人份(28.8%，19/ 66)，未檢出其它基因型。

3 討論

我國是HBV感染高流行國家，一般人群HB-sAg攜帶率為7.18%，其中江西地區13.12%[6]，因此，HBV感染仍是威脅我國輸血安全的重要因素之一。目前，我國采供血機構主要采用ELISA法進行HBsAg篩查，其試劑靈敏度可達0.1～0.2ng/ml[7]，故絕大部分HBV感染獻血者被排除在外。由于ELISA法存在一定的方法局限性，且HBV感染者免疫狀態存在多樣性，如OBI、病毒變異、感染窗口期等[8]，可致獻血者體內存在一定程度的低病毒載量HBV DNA復制而出現漏檢。若輸注了該類血液制品，能否感染HBV取決于病毒載量、機體免疫狀態、計劃免疫等多方面因素，有輸注含HBV DNA的HBsAg陰性獻血者血液致輸血后HBV感染的個例報道，因此有必要在常規血液篩查的基礎上增加HBV DNA檢測[9，10]。

目前全國血站核酸檢測工作已逐步在各地區普及，主要采用NAT篩查血液中是否存在HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA，在降低輸血后HBV感染風險方面具有靈敏度高、特異性強的優勢。報道數據表明我國獻血者經HBsAg篩查后的HBV DNA檢出率為1/10000～2/1000，高于美國、德國、日本等發達國家[4,5,11-14]，且地區間差異較大。本研究ELISA法HBsAg檢測陰性標本HBV DNA陽性率為0.13%，略高于國內的報道數據，與地屬HBV感染高流行地區有關；其血清乙型肝炎標志物檢測提示多為隱匿性感染，病毒載量多以＜20IU/ml為主。因此，綜合HBsAg ELISA法和NAT兩種血液篩查模式，可最大限度的降低輸血后感染風險，從而進一步提高輸血安全性。

根據HBV DNA全基因序列異源性≥8%或S基因序列異源性≥4%的原則，HBV基因型可分為A-J 10種基因型[15，16]，報道顯示我國A、B、C、D基因型均有分布，其中以B、C基因型為主，北方地區以C基因型為主，南方地區以B基因型為主，且隨地區維度增加，C基因型分布增加，B基因型分布降低，地區間由于人群類別的關系，基因型分布差異較大，其中江西地區的報道數據為B基因型約70%～90%，C基因型為10%～20%不等，D基因型少見，約占1%[17-19]。本研究選取的148 HBV DNA陽性標本中，66份測序分型成功，成功率略低主要與絕大部份HBV感染的獻血參與者被排除，檢測者病毒載量低，提取難度大有關；測序結果顯示以B基因型為主(71.2%，47/66)，C基因型次之，數據略低于以往報道數據，這與南昌地區獻血者人群特點有關，但也不排除研究樣本選取偏差因素。

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R193.9,R512.6+2

A

1674-1129(2014)04-0386-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.007

錢榕，女，出生于1962年7月，碩士學位，副主任技師、醫學檢驗專業、采供血管理研究。

2014-05-14；

2014-06-04)

江西省科技廳課題項目(編號:20122BBG70115)