高脂飼養結合腹主動脈球囊損傷制作兔腹主動脈粥樣硬化模型的研究*

楊 俊 岳增輝 謝 濤 胡崗珠

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000）

兔是食草動物，對高脂飼料敏感，是較易建立動脈粥樣硬化的動物之一。此模型特點是復制簡單、建模時間短、成活率高、損傷條件可控性好、易于評判，適用于預防治療等研究。本課題組曾采用高脂加免疫損傷的方法造模，但存在造模周期長、兔死亡率較高的缺點［1-2］。現在多采用高脂喂養結合球囊損傷術建立腹主動脈粥樣硬化（AS）模型的方法，比之于以前的高脂結合免疫損傷的方法縮短了造模時間，且造模成功率更高、更穩定，但還是存在動物死亡率較高的問題［3］。為縮短造模時間及降低死亡率，本實驗采用高脂喂養結合球囊損傷的方法，但調整了高脂飼料的配方，同時更加注重實驗兔的飲食、衛生及術后感染預防，以此縮短造模時間及控制死亡率，為研究AS提供最佳的實驗模型。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 TGL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業有限公司）；全自動生化分析儀Roche Hitachi917型（日本日立公司）；瑞典產LKB-Ш型超薄切片機；LEICADM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司）等；球囊導管與附件（2.5~3.0 mm×20 mm普通球囊導管，美國Cordis公司；0.018/300 cm導引導絲，美國Cordis公司；球囊擴張壓力泵，美國Cordis公司）；膽固醇（sigma公司）；蛋黃粉（安徽亳州市眾意蛋業有限責任公司）；豬油（市售）。

1．2 實驗動物 雄性新西蘭大耳白兔（普通級）20只，體質量1.5～2.0 kg，月齡2～3個月，由長沙市天勤生物技術有限公司提供 ［許可證號：SCXK （湘）2009-0012］。20只兔全部采用高脂喂養加球囊損傷法造模，喂含2%膽固醇、15%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和5%豬油的顆粒飼料，每次50 g，每日早晚2次。普通飼養1周、高脂喂養2周后實施腹主動脈球囊損傷術，術后繼續高脂飼料喂養。所有動物均單籠喂飼，飲水不限，自由攝食，每日每只進食120 g飼料，術后喂養8周。每只分籠圈養于動物中心實驗室。于第10周末處死前頸靜脈采血，取損傷段腹主動脈固定、切片、HE染色。

1．3 球囊損傷腹主動脈內膜的方法 實驗兔術前12 h禁食，不禁水。手術器械術前消毒30 min，稱體質量，3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈麻醉。出現呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲鈍標志麻醉成功。球囊損傷方法：麻醉后經耳緣靜脈注射肝素鈉200 U/kg，固定，將兔右側大腿內側毛發剪去。常規消毒皮膚，鋪巾。在股動脈搏動明顯處沿右股動脈走行方向縱行逐層切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露股動靜脈并游離股動脈約2~3 cm。將股動脈近心端穿線提起，遠心端結扎。用剪刀斜向將股動脈剪一小口，送入軟頭導絲，沿導絲導入球囊導管深度約20 cm。向球囊內注入肝素，保持壓力為6~8標準大氣壓（atm），抗阻力牽拉球囊至髂動脈，抽空球囊。重復上述過程2次后退出導管，結扎股動脈，逐層縫合，碘伏擦拭創口。視出血量補充生理鹽水。術后連續3 d肌注青霉素40 U并用碘伏擦拭傷口預防感染。放回兔籠，自行蘇醒。

1.4 標本采集與檢測 高脂喂養10周，經兔耳緣靜脈麻醉后取頸靜脈血離心，取血清進行血脂檢測。解剖實驗動物，根據球囊損傷術中球囊導管進入的深度及損傷長度，截取損傷段腹主動脈約1.5~2.0 cm，用生理鹽水稍沖洗后以4%多聚甲醛保存，用于拍照和HE染色，光鏡觀察。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以表示，采用t檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 部分兔因用籠具喂養時間長出現足癬，用10 g/L克霉唑液進行局部噴灑并定期消毒籠具后消失。無實驗兔出現腹瀉情況，2只兔麻醉意外死亡，3只死于術后感染。

2.2 造模前后體質量變化 兔實驗的體質量（2.10±0.12） kg，造模 10 周后為（2.90±0.35） kg，有明顯增加（P＜0.05）。

2.3 造模前后血脂水平變化 見表1。血脂檢測結果示，造模后TC、TG、LDL顯著升高，HDL顯著降低（P＜0.05或 P＜ 0.01）。

表1 造模前后兔的血脂情況（mmol/L

表1 造模前后兔的血脂情況（mmol/L

與造模前比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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2.4 病理形態學結果 （1）肉眼觀察。見圖1。造模前兔主動脈形態正常，活體狀態下柔軟而有彈性，取材后見管腔內膜光滑且管腔壁較薄，顏色粉紅均勻，未見脂質沉積。造模后家兔主動脈管腔壁增厚，可見突起于內膜表面的散在、大片、大小不等的黃白色脂質條紋及隆起的脂質斑塊形成；解剖見肝臟明顯脂肪肝改變。（2）光鏡觀察。見圖2。造模前可見主動脈內膜完整，內皮細胞單層緊貼內彈力板，中層平滑肌細胞排列有序，內膜無淋巴細胞、泡沫細胞聚集；彈力纖維無斷裂及溶解現象，無增生現象；胞漿呈嗜酸紅染，無明顯脂質沉積。造模后可見主動脈內皮細胞脫落，斑塊厚度與內中膜厚度比值顯著增加，內膜下可見大量泡沫細胞和淋巴細胞聚集，呈圓形或長形，可見“纖維帽”現象，斑塊中可見新生血管；中層平滑細胞排列紊亂，彈力纖維斷裂、溶解，斑塊向管腔凸出，膠原增生。

圖1 肉眼觀察

圖2 光鏡觀察

3 討 論

目前有研究表明，制作AS模型較為理想的動物當屬小型豬［4］，但存在來源困難、飼料昂貴等缺點，而家兔來源廣泛、飼料便宜，形成的斑塊與人類相似性也較高，是AS的易感動物，因此常選兔作為AS的模型［5］。 內皮損傷是 AS 形成的基礎［6］，脂質沉積是粥樣硬化病變的基本表現［7］。所以，在復制粥樣硬化動物模型時應在損傷內皮的基礎上高脂喂養。故筆者采用腹主動脈球囊損傷加高脂喂養的方法制作AS模型。此方法的優點是操作簡單、死亡率低、損傷較小，且所制作的模型與人類接近，易于確定病變部位，方便取材。

本模型制作與業者［3］造模比較，明顯縮短了造模時間（2周），且未出現實驗兔因腹瀉而死亡的情況，成功降低了死亡率。分析主要原因是：（1）加大了高脂飼料中膽固醇、蛋黃粉、豬油的比例；（2）動物房環境潮濕，定期對動物房及籠具進行清洗、消毒，可避免因感染導致腹瀉而死亡；（3）術后在青霉素抗感染的同時每日擦拭碘伏，控制術后傷口感染。

［1］ 岳增輝，何新群，常小榮，等.隔藥餅灸對動脈粥樣硬化兔血脂的調節作用［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（5）：47-48.

［2］ 何新群，岳增輝，常小榮，等.動脈粥樣硬化兔模型的建立及評價［J］.湖南中醫藥大學學報，2010，30（9）：27-29.

［3］ 吳同啟，顧寧.寧心痛顆粒干預模型兔動脈粥樣硬化易損斑塊機制研究［J］.中華中醫藥雜志，2011，26（5）：1042-1046.

［4］ 劉錄山，楊永宗，馮大明，等.小型豬動脈粥樣硬化斑塊穩定性模型研究［J］.生物化學與生物物理進展，2006，33（2）：196-200.

［5］ Rafael A，Nalkov，Donald C，et al．Carbohydrate and lipid metabolismin farmanimals［J］．The Journal of Nutrition，2007，137（3）：702-705．

［6］ 周曉峰，王佐.內皮祖細胞在動脈粥樣硬化進程中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15（12）：940-942.

［7］ 張運.動脈粥樣硬化研究的當前問題［J］.中華心血管病雜志，2011，39（9）：785-788.

［8］ 常小榮，嚴潔，岳增輝，等.隔藥餅灸對高脂血癥兔高低密度脂蛋白含量及比值的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2004，11（12）：1054-1055.