急性髓系白血病患者骨髓細胞中上皮鈣黏著蛋白和β-連環蛋白的基因表達水平及其臨床意義

許 娜，周 旋，肖小珍，盧綺思，肖雅娟，高冠倫，周紅升，徐 丹，劉曉力

骨髓微環境不僅支持正?；驉盒栽煅毎纳L、增殖，還能保護腫瘤細胞逃避化療藥物引起的凋亡，其中骨髓基質細胞可分泌多種細胞黏附因子介導耐藥[1]，是近幾年國內外學者研究的熱點。上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin，E-cad)是鈣黏蛋白家族成員之一，表達于骨髓基質細胞和CD34+造血干細胞，介導造血細胞與骨髓基質細胞的相互作用，E-cad可直結合β-連環蛋白(β-catenin)形成復合物抑制Wnt/β-catenin通路激活[2]。本研究應用實時定量PCR方法檢測急性髓系白血病(AML)患者骨髓細胞中E-cad和β-catenin基因表達水平，為深入研究骨髓微環境介導的耐藥提供實驗室基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年9月—2012年7月南方醫科大學南方醫院血液科診治的初發AML患者75例(AML組)，均符合原發性AML診斷標準[2]，均知情同意。其中男41例，女34例；年齡為13～67歲，中位年齡35歲。按照FAB分型：M1 3例、M2 27例、M3 7例、M4 16例、M5 22例。其中55例完成染色體核型分析，包括正常核型31例，染色體異常24例。另選取同期我院診治的非惡性血液病患者20例為對照組，其中缺鐵性貧血13例，特發性血小板減少性紫癜7例；男12例，女8例；年齡為15～60歲，中位年齡34歲。兩組患者性別構成及年齡間有均衡性。

AML組患者誘導緩解方案：非M3患者采用DA(柔紅霉素、阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔紅霉素、阿糖胞苷)、TA(吡喃阿霉素、阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)方案；M3患者采用全反式維甲酸誘導分化治療。共有7例進行自體干細胞移植，3例進行異基因干細胞移植，隨訪370 d。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄為cDNA 取肝素抗凝骨髓液3～5 ml，常規Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，TRIzol提取細胞總RNA，經紫外分光光度計和10%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量和濃度。按照反轉錄酶試劑盒(TAKARA公司)說明書中的步驟反轉錄cDNA。

1.2.2 實時定量PCR檢測E-cad和β-catenin基因表達 引物由上海英駿生物技術有限公司合成，E-cad上游引物：5′-GGCTCAAGCTATCCTTCAC-3′，下游引物：5′-CTTGAGCCCAGGAGTTTGAG-3′；β-catenin上游引物：5′-ACCTTTCCCATCATCGTGAG-3′，下游引物：5′-AATCCACTGGTGAACCAAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-CAGTTGCCATGTACCCCT-3′，下游引物：5′-GCTGCCCACAGAATAGCTTC-3′。按SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TAKARA公司)說明書進行?？傮w系20 μl，SYBR Premix 1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌三蒸水7.2 μl。循環條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s；72 ℃ 30 s；40個循環。每個標本均做2個平行管，取2管平均Ct值計算2-ΔCt值作為各標本mRNA的相對表達量，-ΔCt=(目的基因Ct值-內參基因Ct值)。

比較AML組與對照組、AML組不同FAB分型間、AML合并髓外浸潤組與無髓外浸潤組、難治性AML組與非難治性AML組E-cad、β-catenin mRNA的表達水平，探討E-cad、β-catenin mRNA的表達水平與臨床特征的關系?；颊叱霈F下列情況之一即為髓外浸潤：(1)病理學證實為髓外浸潤；(2)臨床上有肝、脾、淋巴結腫大、牙齦增生腫脹、胸腔積液、腦脊液，或胸片、B超等客觀檢查發現病變，排除其他病因且化療有效。難治性AML的標準：將2個療程未達完全緩解(CR)、首次CR后6個月內復發、首次CR后6個月后復發但經正規誘導化療失敗、多次復發定義為難治性AML。上述標準均參照張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》[3]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統計檢驗。由于E-cad、β-catenin mRNA的表達水平不符合正態分布，故以中位數(M)、四分位間距(QR)描述，組間比較采用獨立樣本非參數檢驗(Mann-Whitney U test)；相關分析采用Spearman相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 熔解曲線及擴增效率一致性分析 所提取的RNA經分光光度計檢測吸光度(A)，A260 nm/A280 nm值均在1.8～2.0，純度較高，可用于實時定量PCR檢測。實時定量PCR在反應結束后，儀器自動進行了熔解曲線分析，可見到一個銳利峰形，特異性擴增產物熔解溫度均一(見圖1)，說明特異性擴增產物較為單一。應用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，可見β-catenin、GAPDH基因PCR產物位于200～400 bp之間靠近200 bp處，E-cad PCR產物位于600～800 bp之間靠近600 bp處，與預期位置226、225、630 bp相符(見圖2)，且條帶致密、明亮，無引物二聚體和非特異性擴增，說明擴增產物正確，引物特異性好。

注：A為E-cad，B為β-catenin，C為GAPDH

圖1 實時定量PCR擴增曲線和溶解曲線

Figure1 Amplification curve and melting curve of real-time PCR

圖2 實時定量PCR擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure2 2% agarose gel electrophoresis of the real-time PCR amplification product

2.2 E-cad和β-catenin mRNA表達水平比較 AML組E-cad mRNA、β-catenin mRNA表達水平分別為0.003(0.007)和0.026(0.311)，與對照組的0.091(0.109)和0.004(0.011)比較，差異均有統計學意義(z=-5.425，P=0.000；z=-6.016，P=0.000)。AML組不同FAB分型間E-cad、β-catenin mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 AML組不同FAB分型間E-cad、β-catenin mRNA表達水平比較〔M(QR)〕

Table1 Comparison of expression of E-cad and β-catenin mRNA in AML patients with different FAB type

FAB分型例數E-cadβ-cateninM1 3 0.004(0.003)0.100(0.130)M2270.004(0.005)0.091(0.103)M3 7 0.005(0.004)0.032(0.029)M4160.004(0.003)0.080(0.083)M5220.003(0.004)0.107(0.098)z值7.1664.992P值0.1270.288

注：E-cad=鈣黏著蛋白，β-catenin=β-連環蛋白

2.3 E-cad和β-catenin mRNA表達水平與臨床特征的關系 Spearman相關分析顯示，E-cad mRNA表達水平與乳酸脫氫酶水平呈負相關(P<0.05),而與年齡、初發時白細胞計數、外周血及骨髓原幼稚細胞比例均無線性相關(P>0.05)。β-catenin mRNA表達水平與患者年齡、初發時白細胞計數、外周血原幼稚細胞比例均無線性相關(P>0.05)，而與患者乳酸脫氫酶水平、骨髓原幼稚細胞比例呈正相關(P<0.05，見表2)。

表2 AML患者E-cad和β-catenin mRNA表達水平與臨床特征的相關性

Table2 Correlation analysis between E-cad and β-catenin mRNA expression with AML clinical characteristics

M(QR)E-cadrs P值β-cateninrs P值年齡(歲) 35(36) 0.0250.833-0.2200.427白細胞計數(×109/L) 43(43) 0.0270.820 0.0200.862乳酸脫氫酶(U/L)372(381)-0.1230.000 0.5500.000外周血原幼稚細胞比例(%)32.0(31.8)-0.0430.716-0.1900.102骨髓原幼稚細胞比例(%)53.0(51.1) 0.0450.529 0.6990.000

2.4 E-cad和β-catenin mRNA表達水平與髓外浸潤及療效的關系 75例AML患者中，17例患者合并髓外浸潤(髓外浸潤組)，58例患者無髓外浸潤(無髓外浸潤組)。兩組患者E-cad、β-catenin mRNA表達水平間差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

75例AML患者中，3例患者放棄治療、4例患者治療不足1療程未列入統計，其余68例患者均列入治療反應分析，其中難治性AML組14例，非難治性AML組54例。兩組患者E-cad、β-catenin mRNA表達水平間差異均有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表3 髓外浸潤組和無髓外浸潤組AML患者E-cad、β-catenin mRNA表達水平比較〔M(QR)〕

Table3 Comparison of E-cad and β-catenin mRNA with and without extramedullary leukemia in AML

組別例數E-cadβ-catenin髓外浸潤組170.001(0.001)0.140(0.152)無髓外浸潤組580.004(0.006)0.098(0.099)z值-4.080-5.990P值 0.000 0.000

表4 難治性AML組和非難治性AML組患者E-cad、β-catenin mRNA表達水平比較〔M(QR)〕

Table4 Comparison of E-cad，β-catenin mRNA expression with and without refractory leukemia in AML

組別例數E-cadβ-catenin難治性AML組140.002(0.002)0.120(0.130)非難治性AML組540.015(0.016)0.045(0.045)z值7.83611.019P值0.030 0.021

3 討論

近年來研究發現E-cad介導的細胞黏附除了與腫瘤侵襲、轉移有關外，還可能參與細胞存活[4]。有研究表明，E-cad功能失活可能破壞造血干細胞和骨髓基質間的細胞黏附和信號傳導，進而促進造血細胞惡性增殖并向外周血逃逸[5]。E-cad部分功能需依賴β-catenin來完成，細胞膜上的β-catenin可與E-cad內肽段結合形成復合體進而介導細胞組織結構的形成及黏附。生理情況下β-catenin主要在細胞膜上表達，其轉錄活性是低的，主要以介導黏附作用為主；如果在細胞質或細胞核中出現β-catenin的聚集，將激活Wnt/β-catenin通路，促進細胞惡性增殖。

E-cad表達缺失時，一方面β-catenin在細胞質內聚集到一定量后轉位到細胞核中，與轉錄因子TCF/LEF結合形成TCF/LEF/β-catenin復合體，TCF/LEF抑制作用被解除，由轉錄抑制劑轉變為轉錄激活劑，特異地啟動下游靶基因如c-myc、CyclinD1等癌基因的轉錄和表達，引起細胞增殖加快，從而抵抗凋亡；另一方面，可使白血病細胞從彼此的連接中解離、遷移出來，并破壞造血微環境的穩態，獲得侵襲性表型，使白血病細胞脫離其他細胞的黏附并進一步分散和轉移。最近亦有報道E-cad在維持胚胎干細胞歸巢及抑制腫瘤干細胞轉移過程中起了重要作用[6]。

E-cad、β-catenin在上皮起源腫瘤中的作用已基本明確，而對其在血液系統惡性疾病中的作用研究相對較少。唐克晶等[7]應用反轉錄PCR檢測出急性白血病患者E-cad低表達或缺失可能與E-cad基因CDH1啟動子甲基化有關。Xu等[8]采用免疫組化的方法研究發現β-catenin在AML中表達增高，且與預后密切相關，其中β-catenin在細胞質中的異常積累是關鍵環節，而蛋白水平的增高涉及其合成的增多及降解的減少，Wnt通路主要在蛋白降解水平上對β-catenin進行調節，而對于β-catenin轉錄水平的研究國內外報道較少。饒青等[9]研究發現，E-cad細胞膜表達缺失與其甲基化有關，而β-catenin在AML中存在定位異常，進而推測β-catenin的異常定位可能參與白血病的發生，但該異常定位是否發生在轉錄水平上尚不明確。目前關于白血病細胞中是否存在β-catenin轉錄水平異常仍存在爭議。

本研究采用實時定量PCR方法檢測了75例AML患者E-cad和β-catenin的基因表達水平，發現與非惡性血液病患者比較，AML患者E-cad基因失表達或低表達，β-catenin基因表達水平則較高；同時，AML合并髓外浸潤者β-catenin mRNA表達水平明顯升高，而E-cad mRNA幾乎不表達。E-cad介導的細胞黏附使上皮細胞保持正常極性及同型細胞緊密連接的分子基礎，在正常上皮細胞生長的“接觸抑制”中起著重要作用[10-11]。因此，推測在AML中低表達或失表達的E-cad使cadherin-catenin復合體難以形成，而黏附復合體結構的破壞，使細胞之間的黏附能力降低，從而促進急性白血病細胞髓外浸潤的形成。進一步分析E-cad、β-catenin基因表達與臨床特征的關系，發現β-catenin mRNA表達水平與患者乳酸脫氫酶水平、骨髓原幼稚細胞比例呈正相關；且在難治性AML中，β-catenin表達水平明顯增高，可能因為細胞膜E-cad表達的缺失，破壞了E-cad維持細胞間黏附的平衡，并促進了β-catenin在細胞內的聚集，從而激活Wnt/β-catenin通路，導致白血病細胞惡性增殖、凋亡受抑。

本研究初步證實了E-cad缺失可引起β-catenin被釋放轉入細胞核引起一系列癌基因的轉錄，為闡明E-cad介導的造血細胞與骨髓基質細胞間相互作用的喪失在白血病發生中的作用及機制提供了實驗依據。

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4 Inge LJ，Barwe SP，D′Ambrosio J，et al.Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor[J].Exp Cell Res，2011，317(6)：838-848.

5 Klopp AH，Lacerda L，Gupta A，et al.Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells[J].PLoS One，2010，5(8)：e12180.

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7 唐克晶，饒青，孟繼虹，等.E-cadherin表達缺失在白血病細胞行為中的作用[J].中國病理生理雜志，2009，25(3)：489-492.

8 Xu J，Suzuki M，Niwa Y，et al.Clinical significance of nuclear non-phosphorylated beta-catenin in acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome[J].Br J Haematol，2008，140(4)：394-401.

9 饒青，徐智芳，王繼英，等.E-cadherin在白血病細胞膜表面的表達及與β-catenin細胞膜定位的關系[J].中華血液學雜志，2008，29(9)：592-594.

10 Kim NG，Koh E，Chen X，et al.E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(29)：11930-11935.

11 安繼榮，張亞珍，劉小峰，等.上皮鈣黏蛋白和黏附分子CD44V6及基質金屬蛋白酶2在賁門癌中的表達及意義[J].中國全科醫學，2011，14(10)：3364.