Hedgehog信號通路成分SHH和Gli-1及血管內皮生長因子在人肺癌中的表達

鄭曉文，陳一強，孔晉亮，張劍鋒，經慶玲

目前，肺癌仍是癌癥導致的死亡中的首要原因，是一種具有高轉移潛能的高侵襲性惡性腫瘤，有很大一部分的肺癌明確診斷的時候已經處于晚期，錯過最佳的治療時機。異常激活的Hedgehog信號通路已經在很多腫瘤中發現，如基底細胞癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等[1-5]。Hedgehog信號通路有SHH、DHH、IHH 3個配體，其中最常見的是SHH，通過與ptch1結合，解除對SMO的抑制，啟動Gli-1核轉錄，激活HH靶基因的轉錄。Hedgehog信號通路成分的異常高表達常與腫瘤增強的遷移和侵襲能力相關[6]。Hedgehog信號通路的靶基因常是生長因子或生長因子受體，包括胰島素樣生長因子2(IGF-2)、血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα)[7]。本研究通過檢測人肺癌組織中的Hedgehog信號通路主要成分SHH、Gli-1及靶基因VEGF的表達，分析其與不同臨床病理特征的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年3—10月廣西醫科大學第一附屬醫院臨床病理明確診斷為肺癌，并行外科手術治療的患者72例為研究對象，取癌組織及癌旁組織(距離癌組織5 cm)。其中男40例，女32例；年齡33～84歲，平均(57.7±13.1)歲；腺癌50例，鱗癌12例，小細胞癌4例，其他6例。有吸煙史36例，術前有化史4例。另選取同時期良性肺病變組織30例為對照組，其中男18例，女12例；年齡39～67歲，平均(45.8±10.3)歲；包括支氣管擴張12例，肺結核球9例，肺炎性假瘤5例，肉芽腫性炎3例，肺氣腫1例。本研究取得廣西醫科大學第一附屬醫院倫理審查委員會的審查批準。

1.2 實驗材料 RNA樣品保存液(TIANGEN，DP408)；反轉錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕；定量PCR試劑盒(Roche)；SHH抗體(Santa Cruz，sc-1194)，Gli-1抗體(Santa Cruz，sc-20687)，VEGF單克隆抗體(Origene，TA500042)。

1.3 實時熒光定量PCR引物序列 在美國國立生物技術信息中心(NCBI)基因庫查到相應的基因序列，采用Oligo 5.0進行引物設計，然后在NCBI上進行Primer-BLAST，采用評分最高的引物序列。引物序列的合成由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(見表1)。

1.4 免疫組織化學法檢測肺癌組織SHH、Gli-1、VEGF的表達 將取得的癌組織、癌旁組織、良性肺病變組織經甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，熱修復后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加一抗(SHH 1∶50，Gli-1 1∶75，VEGF 1∶100)，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，加入酶標二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色3～5 min，鏡下監控顯色程度。蒸餾水沖洗3次，Mayer蘇木素10～20 s，分化，返藍。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察結果并拍照。鏡下可見相應定位區域出現明顯棕黃色顆粒為陽性，按陽性細胞數和染色強度進行半定量:0分：無陽性細胞，1分：陽性細胞≤25%，2分：陽性細胞26%～50%，3分:陽性細胞>50%；按染色強度:0分：無著色，1分：淺棕色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。每張切片兩項得分相乘:0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中陽性，>4分為強陽性。3分以上定為陽性表達。

表1 引物序列及產物長度Table 1 Primer sequences and the length of amplified products

注：VEGF=血管內皮生長因子

1.5 實時熒光定量PCR檢測肺癌組織的SHH、Gli-1、VEGF mRNA的表達 將癌組織、癌旁組織、良性肺病變組織用0.9%氯化鈉溶液清洗后放入至RNA樣本保存液中，存至-80 ℃冰箱中。肺癌組織在研缽中碾碎后，用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，電泳判斷總RNA的完整性，反轉錄試劑盒獲得cDNA，進行實時熒光定量PCR反應，反應體系20 μl〔Mix 10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.6 μl，下游引物(10 μmol/L)0.6 μl，cDNA 1 μl，雙蒸水7.8 μl〕。反應條件95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min(40個循環)。60 ℃收集熒光。軟件生成的標準曲線R2均大于0.99，擴增效率為90%～110%。按以上體系以及條件分別測定待測樣本目的基因及內參的Ct值，2-ΔΔCt法計算基因表達的差異。

2 結果

2.1 SHH、Gli-1、VEGF在肺癌組織、癌旁組織、良性肺病變組織的表達情況 SHH、Gli-1、VEGF陽性染色均呈棕黃色，SHH主要表達在肺癌組織的腫瘤細胞中，定位在胞質。Gli-1和VEGF在肺癌組織中主要表達在胞質中(見圖1)。

肺癌組織中SHH陽性表達率為73.6%(53/72)，癌旁組織為16.7%(12/72)，良性肺病變組織為6.7%(2/30)，差異有統計學意義(χ2=64.819,P<0.05)；其中肺癌組織和癌旁組織SHH陽性表達率高于良性肺病變組織，肺癌組織SHH陽性表達率高于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.01)。肺癌組織中Gli-1陽性表達率為30.6%(22/72)，癌旁組織為8.3%(6/72)，良性肺病變組織為6.7%(2/30)，差異有統計學意義(χ2=15.300,P<0.05)；其中肺癌組織和癌旁組織Gli-1陽性表達率高于良性肺病變組織，肺癌組織Gli-1陽性表達率高于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.01)。肺癌組織中VEGF陽性表達率為75.0%(54/72)，癌旁組織為69.4%(50/72)，良性肺病變組織為16.7%(5/30)，差異有統計學意義(χ2=34.530,P<0.05)；其中肺癌組織和癌旁組織VEGF陽性表達率高于良性肺病變組織，差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.2 SHH、Gli-1、VEGF陽性表達率與肺癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、吸煙史、分化程度、術前放化療肺癌患者Gli-1陽性表達率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、早晚期、分化程度、病理類型、術前放化療肺癌患者VEGF陽性表達率比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 SHH、Gli-1、VEGF mRNA在肺癌組織、癌旁組織、良性肺病變組織的表達情況 肺癌組織中SHH mRNA相對表達量為(60.857±5.446)，癌旁組織為(10.848±1.600)，良性肺病變組織為(25.763±2.178)，差異有統計學意義(F=110.982,P<0.05)。肺癌組織中Gli-1 mRNA相對表達量為(9.804±1.054)，癌旁組織為(5.661±0.612)，良性肺病變組織為(3.551±0.545)，差異有統計學意義(F=59.183,P<0.05)。肺癌組織中VEGF mRNA相對表達量為(0.574±0.051)，癌旁組織為(0.495±0.027)，良性肺病變組織為(0.357±0.030)，差異有統計學意義(F=6.061,P<0.05)。

2.4 SHH、Gli-1、VEGF mRNA相對表達量與肺癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、吸煙史、TNM分期、分化程度、病理類型、術前放化療肺癌患者Gli-1 mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同分化程度、術前放化療肺癌患者VEGF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 SHH、Gli-1、VEGF陽性表達率與肺癌患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕Table 2 Correlations of SHH，Gli-1，VEGF expression with clinicopathologic characteristics in human lung cancer

注：-為Fisher確切概率法

2.5 肺癌組織中SHH、Gli-1和VEGF的表達與mRNA相對表達量的相關性分析 肺癌組織中SHH、Gli-1和VEGF的表達與mRNA相對表達量均呈正相關(P<0.05，見表4)。

3 討論

Hedgehog信號通路在脊柱動物中呈保守狀態，在哺乳動物的發育過程中高度激活，特別是神經管和骨骼中，但是隨即沉默在大多數成熟組織中。然而，一些生后成熟的器官，比如中樞神經系統、肺臟，在損傷后依靠持續的Hedgehog信號通路來維持組織的內環境穩定和修復[8]。異常調節的Hedgehog信號通路在腫瘤一系列關鍵生物過程中起作用，如細胞增殖、細胞周期的調節、抗凋亡蛋白的下調、EMT形成和干細胞信號途徑[9]。

表4 肺癌組織中SHH、Gli-1和VEGF的表達與mRNA相對表達量的相關性分析

Table4 Correlation analysis of protein and mRNA level of SHH,Gli-1 and VEGF

r值P值SHH0 7180 000Gli-10 7960 000VEGF0 8740 000

表3 SHH、Gli-1、VEGF mRNA相對表達量與肺癌患者臨床病理特征的關系Table 3 Correlations of SHH,Gli-1 and VEGF mRNA expression with clinicopathologic characteristics in human lung cancer

注：*為F值

呼吸道損傷修復期上皮組織內Hedgehog信號通路被廣泛激活，通過調控干細胞/祖細胞的增殖分化，促進組織修復[10]。目前Hedgehog信號通路在肺癌中表達的研究結果不盡相同。Watkins等[10]用7個小細胞肺癌(SCLC)細胞系和7個非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系在體外培養，這些肺癌細胞系均表達SHH，7個SCLC有5個同時表達SHH和Gli-1；NSCLC中SHH表達下降，均無Gli-1表達。有學者用免疫組織化學法檢測40例SCLC組織中Gli-1表達率為34例(85%)，其中26例為中陽性或強陽性，同時檢測18種SCLC細胞系，僅有一種表達Gli-1，提示Gli-1在體內的表達高于體外[11]。

本研究中72例肺癌中腺癌50例，鱗癌12例，小細胞癌4例。其中36例腺癌、8例鱗癌、3例SCLC SHH表達陽性，14例腺癌、6例鱗癌Gli-1表達陽性，40例腺癌、10例鱗癌VEGF表達陽性。SHH及Gli-1的陽性表達率與病理類型無關，VEGF在腺癌中的表達率高于鱗癌和小細胞癌。在研究中共納入4例有化療史的患者，術前均進行3或4次化療，病理類型為腺癌，具體的化療方案不詳，Gli-1陽性表達率明顯高于未化療的肺癌組織，VEGF的表達卻低于化療后肺癌組織。這與目前的肺癌化療的耐藥性形成有關，肺癌組織在藥物的作用下產生了某些適應性的變化，可導致多種分子和信號通路異常，當激活Hedgehog信號通路則異常表達Gli-1。而VEGF的變化則是多種因素共同作用下的結果。

持續激活的Hedgehog信號通路成分——SMO可以在促進人SCLC細胞的克隆形成，促進鼠SCLC的發生和發展，藥理阻斷Hedgehog信號通路則可以抑制人和鼠SCLC的生長，尤其是化療后更加明顯，顯示Hedgehog信號通路在SCLC的發展和維持中起著重要的細胞內作用[12]。本研究在72例肺癌組織中檢測到SHH、Gli-1、VEGF的陽性表達率均高于良性肺病變組織，表明人肺癌組織有異常激活的SHH信號通路，高表達的SHH配體啟動SHH信號通路傳導，導致Gli-1的轉錄，作用于靶基因VEGF，發揮其在腫瘤發生、發展中的調控作用。SHH、Gli-1、VEGF在蛋白水平和基因水平表達呈一致性，表明其在基因水平后翻譯修飾表達至蛋白水平，整個過程呈連續一致性。Raz等[13]的研究結果同樣表明Hedgehog信號通路下游成分以SHH為主，并且在NSCLC中主要以SHH配體依賴的方式發揮作用。

肺癌組織中SHH、Gli-1陽性表達率高于癌旁組織,VEGF陽性表達率在肺癌組織和癌旁組織無差異。具有高轉移傾向的器官表現出明顯的血管生成傾向，高表達VEGF，從而可以刺激巨噬細胞產生金屬基質蛋白酶(MMPs)，降解局部細胞外基質(ECM)，從而使腫瘤細胞增殖[14]。VEGF還可以作為重要成分激活內皮細胞中的αvβ3整合素，在腫瘤的轉移和侵襲中發揮著重要的作用[15]。本研究中VEGF肺癌組織和癌旁組織中同樣高表達，VEGF在伴有遠處轉移、淋巴轉移的肺癌組織中高表達，與其在腫瘤發生過程中促進血管生成的重要作用相關。

Hedgehog信號通路抑制劑GDC-0449可以抑制肺腺癌和SCLC細胞系的細胞生長，增加順鉑的細胞毒效應[16]。Hedgehog信號通路主要成分SHH、Gli-1及VEGF在肺癌中高表達，與腫瘤的發展密切相關，提示基于抑制Hedgehog信號通路及VEGF抑制劑的聯合治療是肺癌分子靶向治療的一項有效措施，可以提高肺癌生物綜合治療的有效性。

注：A為SHH陰性，B為SHH弱陽性，C為SHH中陽性，D為SHH強陽性，E為Gli-1陰性，F為Gli-1弱陽性，G為Gli-1中陽性，H為Gli-1強陽性，I為VEGF陰性，J為VEGF弱陽性，K為VEGF中陽性，L為VEGF強陽性

圖1 肺癌組織、癌旁組織、良性肺病變免疫組織化學法染色(×400)

Figure1 Immunohistochemical staining of human lung cancer tissue,cancer adjacent tissue and benign lung lesions

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