三陰乳腺癌組織中乳腺小黏蛋白和局部黏著斑激酶的表達及意義

張 微，張塵玉，楊志強，遲新楠，岳 莉

乳腺癌是發展中國家女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，每年大約有40萬女性死于該疾病[2]，其中三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是導致治療失敗和死亡的主要類型。TNBC復發和轉移的風險較高[3]，并且容易對蒽環類和紫杉類藥物耐藥，對激素和靶向治療也不敏感，這些藥物治療失敗后沒有更好的解救方案可選擇，是目前臨床治療TNBC最大的難題。在過去的幾十年里，發達國家乳腺癌的發病率持續上升，而病死率則呈現相對下降的趨勢，這得益于良好的醫療環境和體檢的常規化。乳腺小黏蛋白(small breast epithelial mucin，SBEM)近幾年被認為是乳腺癌患者微轉移的分子標志物[4]，在乳腺組織、淋巴結和外周血中檢測到乳腺特異性蛋白的表達，可以早期發現乳腺癌微轉移、預測腫瘤復發、指導臨床用藥等。局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一種非受體酪氨酸激酶，在多種惡性腫瘤中高表達或過度激活[5]，其高表達導致腫瘤細胞的黏附狀態發生改變，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。本研究回顧性分析TNBC患者組織中SBEM和FAK的表達情況，并探討兩者在TNBC中的表達相關性及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2005—2007年遼寧醫學院附屬第一醫院術后診斷為乳腺癌的石蠟標本67例，均為女性，年齡35～68歲，平均52歲，患者術前均未接受放化療及免疫治療。乳腺癌的診斷和分級參照世界衛生組織(WHO)診斷標準，經兩名病理學專家診斷確定TNBC。其中Ⅰ級14例，Ⅱ級29例，Ⅲ級24例；存在淋巴結轉移者35例。免疫組化標本經10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。隨訪從術后第1天開始，主要采用電話、郵件、面談、門診隨訪的方式，每例患者至少隨訪5年。

1.2 主要試劑及方法 (1)兔抗人SBEM與FAK多克隆抗體及免疫組化SP試劑盒購自美國R&B公司。免疫組化技術采用三步法，標本常規采用10%福爾馬林溶液固定，60 ℃烘烤過夜。脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育15 min，PBS沖洗，高壓修復1.5 min，加入一抗(濃度1∶100)4 ℃過夜(4 ℃過夜后在37 ℃復溫45 min)。PBS沖洗3次，加入二抗室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加試劑鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)室溫孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蒸餾水洗，蘇木素對比染色，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。用已知陽性組織切片做陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷 SBEM主要表達于細胞膜，其次表達于細胞質，極少部分表達于細胞核。FAK主要表達在細胞質，以出現棕黃色顆粒判定為陽性細胞(見圖1～4)。根據染色程度及染色陽性細胞占腫瘤細胞總數百分比綜合計分。按照陽性細胞比例計分：<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；不染色記0分，淡黃色記1分，黃色或深黃色記2分，棕黃色記3分。每張切片的兩項得分之和<4分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.4 無病生存期(DFS)和總生存期(OS) DFS的定義是指從隨機化開始至疾病復發或由于疾病進展導致患者死亡的時間。該指標也常作為抗腫瘤藥物Ⅲ期臨床試驗的主要終點。OS的定義是指從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間。該指標常被認為是腫瘤臨床試驗中最佳的療效終點。如果在生存期上有小幅度的提高，可以認為是有意義的臨床受益證據。通過與患者直接接觸或者通過電話隨訪，截止到最后一次有記錄的、與患者接觸的時間。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，不同組間蛋白表達差異采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線；預后因素采用Cox風險比例模型進行多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SBEM和FAK在TNBC組織中的表達與臨床病理特征的關系 SBEM在TNBC中陽性率為52.2%(35/67)，FAK在TNBC中陽性率為68.7%(46/67)。不同病理分級、淋巴結轉移和Ki67表達情況的TNBC患者癌組織中SBEM和FAK陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，而不同月經狀況、年齡、腫塊直徑的TNBC患者癌組織中SBEM和FAK陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05,見表1)。

2.2 SBEM和FAK在TNBC組織中表達的相關性 列聯表獨立性χ2檢驗顯示SBEM與FAK之間有關聯(χ2=15.92,P<0.05)，Pearson列聯系數r=0.438(見表2)。

表1 SBEM和FAK在TNBC組織中的表達與臨床病理特征的關系(例)

Table1 Relationship of SBEM and FAK with clinicopathological features in TNBC

特征例數FAK陽性表達陰性表達χ2值P值SBEM陽性表達陰性表達χ2值P值月經狀況0.01>0.050.03>0.05 絕經3927122019 未絕經281991513年齡(歲)1.39>0.050.07>0.05 ≥504533122421 <50221391111腫塊直徑(cm)0.00>0.050.08>0.05 <23120111516 2～5231581211 >5139485病理分級4.29<0.055.18<0.05 Ⅰ級1459410 Ⅱ級292091415 Ⅲ級24213177淋巴結轉移4.38<0.055.33<0.05 有352872312 無3218141220Ki678.48<0.053.35<0.05 陽性5542133223 陰性124839

注：SBEM=乳腺小黏蛋白，FAK=局部黏著斑激酶

表2 SBEM和FAK在TNBC組織中表達的相關性(例)

2.3 生存分析 所有患者隨訪至2013年3月，中位隨訪時間25.8(11.0～45.1)個月。SBEM陽性組中位DFS為21.4個月，中位OS為28.9個月，SBEM陰性組中位DFS為23.3個月，中位OS為35.6個月，兩組比較差異均有統計學意義(χ2值分別為9.63和8.56，P<0.05，見圖5、6)。FAK陽性組中位DFS為20.7個月，中位OS為25.4個月，FAK陰性組中位DFS為22.9個月，中位OS為32.5個月，兩組比較差異均有統計學意義(χ2值分別為11.37和9.20，P<0.05，見圖7、8)。

2.4 預后因素分析 67例TNBC患者5年無瘤生存率為7.5%，5年總生存率為13.4%。采用Cox模型進行多因素分析，結果顯示，病理分級、淋巴結轉移、Ki67、SBEM和FAK與5年無瘤生存率和5年總生存率有回歸關系(P<0.05，見表3)。

3 討論

TNBC占所有新診斷乳腺癌患者的11%～20%[6]，與其他亞型乳腺癌相比，TNBC患者缺乏激素治療和靶向治療的抗體表型，進展迅速，預后較差[7]。這可能是因為在某些情況下，特定的非規范的治療產生的分子變化可能導致臨床耐藥，因此對TNBC提出有效的治療策略，是控制乳腺癌發展的一個重大挑戰[8]。乳腺癌的發生和發展是一個多基因、多因素參與的復雜過程，淋巴結是乳腺癌復發和轉移最重要的預測[9]，化療耐藥[10]是影響患者預后的重要因素，而侵襲和轉移是惡性腫瘤危及生命的最重要的生物學特征[11]。目前雖然對于腫瘤的侵襲轉移認識在不斷深入，但是，對隱匿性惡性腫瘤的早期發現給予明確的診斷，仍然非常困難，特別是對于一些惡性度特別高的腫瘤，早期發現并控制轉移具有重要的臨床意義。

表3 影響TNBC患者5年無瘤生存率和5年總生存率的多因素Cox分析

Table3 Multiple factors Cox analysis of 5-year DFS and 5-year OS in TNBC patients

因素5年無瘤生存率P值 RR 95%CI 5年總生存率P值 RR 95%CI 病理分級0.0451.128(1.382,5.209)0.0322.309(1.498,8.025)淋巴結轉移0.0231.150(0.598,3.675)0.0162.526(0.790,6.510)Ki670.0012.063(0.500,3.670)0.0021.065(0.376,4.120)SBEM0.0032.097(0.523,4.121)0.0001.204(1.434,5.728)FAK0.0001.034(0.872,5.303)0.0001.153(0.439,3.498)

圖1 SBEM在TNBC組織中陰性表達

Figure1 Negative expression of SBEM in TNBC

圖2 SBEM在TNBC組織中陽性表達

Figure2 Positive expression of SBEM in TNBC

圖3 FAK在TNBC組織中陰性表達

Figure3 Negative expression of FAK in TNBC

圖4 FAK在TNBC組織中陽性表達

Figure4 Positive expression of FAK in TNBC

圖5 SBEM陽性組與SBEM陰性組TNBC患者DFS

Figure5 DFS of TNBC patients in SBEM positive group and SBEM negative group

圖6 SBEM陽性組與SBEM陰性組TNBC患者OS

Figure6 OS of TNBC patients in SBEM positive group and SBEM negative group

圖7 FAK陽性組與FAK陰性組TNBC患者DFS

Figure7 DFS of TNBC patients in FAK positive group and FAK negative group

圖8 FAK陽性組與FAK陰性組TNBC患者OS

Figure8 OS of TNBC patients in FAK positive group and FAK negative group

SBEM僅在乳腺和唾液中表達，在乳腺癌組織及轉移性淋巴結中呈過度表達，Miksicek等[4]于2002年首先報道了該蛋白具有較高的特異性，可能是用于檢測乳腺癌微轉移的生物標志物之一。Skliris等[12]發現SBEM在乳腺癌ER陰性組的陽性表達率明顯高于ER陽性組。Valladares-Ayerbes等[13]評估了SBEM作為一種潛在的腫瘤標志物在乳腺癌骨髓轉移中診斷的準確性，可能與乳腺癌的不同分子亞型相關。目前，SBEM與乳腺癌的關系仍在探討中，其過度表達可能與乳腺癌的TNM分期以及淋巴結轉移均密切相關，對乳腺癌轉移的預測和治療可能具有重要的指導意義。

FAK是由Schaller等首先發現的一種非受體酪氨酸激酶。FAK的高表達導致腫瘤細胞的黏附狀態發生改變，啟動一個“外部”信號級聯[14]，參與調節細胞的存活、運動和黏附，參與細胞骨架的變化和基因轉錄[15]等多種細胞反應。FAK在多種細胞不同功能的調節中具有重要的信號轉導功能，促進乳腺癌細胞的增殖和轉移，是乳腺癌干細胞表面一個重要的生物標志物之一[16]。FAK已被證明在乳腺癌發生的早期階段中會出現過度表達[17]，其高表達是乳腺癌細胞發生侵襲和轉移的重要因素，圍繞FAK開發新的靶向藥物以抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，成為目前的研究熱點之一。

本研究發現SBEM在TNBC中陽性率為52.2%，FAK在TNBC中陽性率為68.7%，兩者在TNBC組織中的表達呈正相關。SBEM及FAK陽性組中位DFS和中位OS均低于陰性組。多因素Cox分析結果顯示：病理分級、淋巴結轉移、Ki67、SBEM和FAK是5年無瘤生存率和5年總生存率的獨立預后影響因素。SBEM及FAK的陽性表達是影響預后的重要因素。SBEM和FAK可能在乳腺癌的發生及發展過程中起著重要的促進作用。這表明兩者的陽性表達可能對乳腺癌的早期轉移是一個潛在的生物學信號，從而對乳腺癌的預后判斷具有重要的指導意義。圍繞這兩個因子開展的靶點研究成為目前的研究熱點，兩者相關性的研究可能為尋找其共同的上游通路提供一定的依據。

盡管目前許多腫瘤標志物已經應用于臨床，但是由于缺乏特異度且敏感度較低等原因，對于腫瘤的診斷以及預后判斷尚未形成統一的標準。雖然，本研究結果支持SBEM和FAK可作為判斷TNBC預后的標志物，但由于樣本量較少，仍需要加大樣本量進一步研究證實，檢測兩者的表達可能為乳腺癌的轉移及預后判斷提供一定的參考。

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