奧美拉唑激活乙醛脫氫酶2的抗神經元凋亡作用研究

鄒浩軍，林莉莉，孫 達

心腦血管缺血性疾病是臨床常見疾病，具有發病率高、病死率高、致殘率高等特點[1-3]，嚴重損害人類健康。因此，尋找有效的防治措施至關重要，如改變生活習慣、降壓降脂、抗動脈粥樣硬化以及相關的基因、蛋白調控，均能有效防治缺血性心腦血管疾病[4]。2008年斯坦福大學Mochly-Rosen D所領導的課題組首次發現乙醛脫氫酶2(ALDH2)對缺血心臟的保護作用，明確顯示激活ALDH2能顯著抑制心肌梗死面積[5]，后期又有研究顯示ALDH2與缺血性腦卒中關系密切[6]。目前已知的ALDH2激動劑為化合物Adal1,故尋找能提高ALDH2活性的藥物有重要意義。本課題組在研究中偶然發現質子泵抑制劑奧美拉唑(OME)能增加ALDH2活性,其是否能通過提高ALDH2活性而保護神經元呢？本研究利用原代神經元缺氧缺糖(OGD)模型，探討OME對原代神經元凋亡的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 清潔級SD孕鼠，購自上海斯萊克動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005；注射用OME(配溶媒)，購自阿斯利康公司；Adal1和Cya均購自Sigma公司；Neurobasal培養基、改良Eagle培養基、胎牛血清均購自GIBCO公司；活細胞計數(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；Hoechst 33342熒光染色試劑盒和TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 原代皮質神經元的培養及鑒定 取妊娠15～16 d孕鼠1只，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒腹部，打開腹腔，取出胎鼠。解剖顯微鏡下分離并剪碎腦組織，用0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴消化10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)終止消化反應。離心后徹底洗凈胰酶，加入接種培養基，200目不銹鋼濾器過濾，以2.5×105/cm密度種板。24 h后更換Neurobasal生長培養基，第5天全量換液，于第7天半量換液后用于實驗。用神經元特異性烯醇化酶抗體進行免疫細胞化學染色，計數陽性神經元達95%以上，符合實驗要求。

1.2.2 實驗分組 神經元增殖和凋亡實驗：將培養的神經元用Rand A 1.0軟件完全隨機分為正常對照組(Control組)、模型組(OGD組)和OGD+OME組(分別加入3、10、30、100、300 μg/ml的OME)。ALDH2激動劑Adal1和阻滯劑Cya對OGD神經元凋亡的影響：將培養的細胞隨機分為Control組、OGD組、OGD+Adal1組和OGD+Cya組。ALDH2活性測定：將培養的神經元隨機分為Control組、OGD組和OGD+OME組(10 μg/ml的OME)。

1.2.3 OGD模型的建立 培養7 d的神經元更換正常培養基為無糖DMEM培養基，置于37 ℃、體積分數為94%氮氣、5%二氧化碳(CO2)的缺氧箱中進行OGD處理12 h。然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率在35%～50%即為造模成功。

1.2.4 CCK-8法檢測神經元的增殖 取細胞密度為2×105/ml對數生長期細胞，每孔100 μl接種至96孔培養板中，Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組各6復孔。24 h后OGD+OME組分別加入終濃度為3、10、30、100、300 μg/ml的OME，OGD組加入等體積溶媒，并均進行OGD處理12 h。采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力：每孔加入10 μl CCK-8檢測液，置37 ℃、5%CO2培養箱孵育4 h后，使用酶標儀于450 nm 波長檢測各孔吸光度值(A450)，重復3次。以OD450表示細胞增殖能力，OD450=實驗組A值/Control組A值×100%。以Control組為標準(即100%)，其他組的OD450值與Control組的OD450值之比即為該組的相對存活率。

1.2.5 Hoechst 33342熒光染色及TUNEL法觀察神經元凋亡 收集Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組處理過的細胞，PBS洗滌1次。加入Hoechst 33342(終濃度10 μg/ml)，常溫下孵育15 min，離心去上清液。然后按照試劑盒說明書進行操作，滴片后于熒光顯微鏡下觀察神經元凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6 Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測神經元凋亡 將Control組、OGD組及不同濃度OGD+OME組、OGD+Adal1組、OGD+Cya組培養12 h的神經元用胰酶消化、吹打，細胞懸浮后用胎牛血清終止消化，PBS洗滌2次。收集細胞，取106/mm3重懸細胞，按Annexin V/PI染色試劑盒說明書操作后，用流式細胞儀檢測、分析神經元凋亡率，實驗重復3次。

1.2.7 ALDH2活性測定 收集Control組、OGD組和OGD+OME組(10 μg/ml的OME)神經元，按照操作說明書提取線粒體蛋白，用二辛可酸法測定蛋白濃度，并用PBS調整蛋白濃度一致。采用半自動生化分析儀測定ALDH2活性：方法為速率法，波長340 nm，溫度37 ℃，讀數時間60 s，延遲時間30 s，吸入量450 μl，反應方向為正方向，因數1 746。因為ALDH2活性測定受到很多因素影響，如溫度、濕度等，而且每次測定時即使條件一致，儀器本身也會影響結果，故每次測定后將Control組ALDH2活性標準化為100%，其他組ALDH2活性再與Control組比較后再相對化，稱為ALDH2相對活性。整個ALDH2活性測定需要重復3次。

2 結果

2.1 OME對OGD神經元增殖的影響 與Control組比較，OGD處理12 h后原代神經元增殖能力(OD450值)下降，差異有統計學意義(P<0.05),相對存活率減少了61.42%；與OGD組比較，10、30 μg/ml OME均能促進神經元增殖，差異有統計學意義(P<0.05)，相對存活率提高；但與OGD組比較，100 μg/ml的OME對神經元的增殖能力無影響，差異無統計學意義(P>0.05)；而與OGD組比較，300 μg/ml的OME反而使細胞增殖能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)，相對存活率下降(見表1)。

2.2 OME對OGD神經元凋亡的影響 Hoechst 33342熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到正常神經元的細胞核染成暗藍色，細胞核大小、形態正常；凋亡的神經元細胞核呈亮藍色、大小不等，核固縮、碎裂甚至可見凋亡小體(如箭頭所示)。TUNEL染色為綠色的即為凋亡細胞核(如箭頭所示)，與OGD組比較，10、30 μg/ml OME使凋亡細胞數目明顯減少(見圖1)。

神經元增殖實驗中設置了OGD+300 μg/ml OME組，發現神經元增殖能力反而下降，可能是藥物濃度太高導致細胞毒性反應，故神經元凋亡實驗中不再設置OGD+300 μg/ml OME組。流式細胞術檢測神經元凋亡率顯示，與Control組比較，OGD處理12 h后神經元凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而與OGD組比較，10、30 μg/ml的OME則可使神經元凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；但與OGD組比較，100 μg/ml的OME對神經元凋亡率無影響，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.3 ALDH2激動劑Adal1和阻滯劑Cya對OGD神經元凋亡的影響 與Control組比較，OGD處理12 h后，神經元凋亡率增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與OGD組比較，ALDH2激動劑Adal1能降低神經元凋亡率，而ALDH2阻滯劑Cya則能增加神經元凋亡率，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表1 各組神經元增殖情況比較

注：OME=奧美拉唑；-表示無數據；與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.05，▲P<0.01

注：a/A為Control組，b/B為OGD組，c/C為OGD+OME 3 μg/ml組，d/D為OGD+OME 10 μg/ml組，e/E為OGD+OME 30 μg/ml組，f/F為OGD+OME 100 μg/ml組

圖1 Hoechst 33342和TUNEL檢測OME對神經元凋亡的影響

Figure1 The effects of OME on neuron apoptosis by Hoechst 33342 fluorescence staining and TUNEL

表2 各組神經元凋亡率比較

注：與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.01，▲P<0.05

表3 Adal1和Cya對神經元凋亡率的影響

注：與Control組比較，*P<0.01；與OGD組比較，△P<0.01；與OGD+Adal1組比較，▲P<0.01

2.4 OME對OGD神經元ALDH2活性的影響 與Control組比較，OGD組神經元ALDH2相對活性降低了74.01%,而10 μg/ml OME使OGD神經元ALDH2相對活性增加了130.00%(見圖2)。

圖2 各組神經元ALDH2相對活性比較

Figure2 Comparison of the activities of ALDH2 in neuron among different groups

3 討論

腦缺血缺氧后，神經元細胞器結構受損，能量代謝障礙、細胞內鈣超載、激發一系列級聯反應導致神經元死亡[7-9]。已有研究發現，缺血性腦病早期，缺血中心神經元死亡以壞死為主；而其周圍(缺血半暗帶) 的神經元仍然具有代謝活性，最終的死亡以凋亡為主[10-12]。由于細胞凋亡是一個長期、慢性的過程，且具有可預防性和可逆的，故在缺血早期前用藥抑制神經元的凋亡，可有效地保護半暗帶神經元，阻止凋亡的發展，從而阻止疾病發展和惡化，使缺血性腦損傷得到有效的治療。因而抑制神經元凋亡也是治療缺血性腦卒中的一個重要策略。

OGD模型又稱氧糖剝奪模型，自Goldberg等[13]成功建立了原代培養神經元OGD模型后，被廣泛用于研究離體水平腦缺血損傷[14]，這一模型不僅能夠模擬整體水平腦缺血損傷，還是離體水平評價藥物神經保護作用的有效手段。因此本研究也選擇在該模型上進行深入探討，結果顯示原代神經元OGD處理后凋亡率增加，顯微鏡下見細胞大小不等，核固縮、碎裂，甚至可見凋亡小體。說明在低氧低糖的情況下，細胞凋亡增加，增殖能力下降，細胞的存活率下降。同時本研究還發現激動ALDH2，能對抗OGD導致的神經元凋亡，而阻斷ALDH2，則使神經元凋亡更加明顯，說明ALDH2活性與神經元凋亡有相關性。加入OME干預后，神經元凋亡減少，增殖能力和存活率增加，且ALDH2活性增高，這表明OME對OGD致神經元的損傷具有一定的保護作用，這與抗凋亡、增高ALDH2的活性相關。但在OME濃度過高(300 μg/ml)時，神經元增殖能力反而降低，這可能與藥物濃度過高帶來的細胞損害作用相關。

ALDH2是存在于線粒體的一種酶，主要功能是參與乙醇的代謝，使乙醇的毒性中間產物乙醛被氧化為無害的乙酸。近年來，許多研究表明ALDH2具有心腦血管保護作用，ALDH2改變與氧化損傷密切相關。有研究表明，激活ALDH2會降低缺血性損傷所致的心肌損害，其機制與ALDH2協同調節心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)內源性保護信號有關[15-16]；對于缺血性腦損傷，ALDH2與腦內蛋白激酶Cε(PKCε)直接相互結合，PKCε可以調節ALDH2的激活，從而發揮腦保護作用[6]。ALDH2過表達小鼠的心肌梗死及腦梗死面積較野生型小鼠顯著減小；反之，ALDH2敲除小鼠的心肌梗死面積及腦梗死面積較野生型小鼠顯著增加。因此，增強ALDH2活性可能為腦缺血的防治提供新的方向。

OME是全球公認的治療消化性潰瘍及反流性食管炎等酸相關性疾病的質子泵抑制劑，臨床也利用其對胃黏膜保護作用而用于急性酒精中毒的治療。本課題組前期實驗偶然發現OME可以提高肝臟線粒體ALDH2活性，考慮OME對血-腦脊液屏障穿透性差，故選擇在離體神經元上研究，發現OME亦能提高神經元線粒體內ALDH2活性，從而促進神經元增殖，抑制神經元凋亡。這也許會給OME的應用帶來新的機遇，但還需要對此進一步探討。

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本文鏈接：

乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)(EC1.2.1.10)(CAS[9028-91-5])是醛脫氫酶的一種，負責催化乙醛氧化為乙酸的反應。肝中的乙醇脫氫酶負責將乙醇氧化為乙醛，生成的乙醛作為底物進一步在乙醛脫氫酶催化下轉變為無害的乙酸(醋的成分)。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。而且乙醛被懷疑具有致癌性，與人類腫瘤的發生存在一定的關系。負責人體內乙醛轉化的主要是肝中的乙醛脫氫酶，乙醛脫氫酶1與乙醛脫氫酶2在催化速率上有很明顯的差異。