性激素對雄性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的影響研究

辛光大，秦少游，王江濱

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是世界范圍內分布的常見的慢性肝病，可進展為肝硬化和肝細胞癌[1-4]。尋找NASH發生、發展的危險因素，探討其防治策略是目前國內外肝病學界的研究熱點之一。流行病學調查顯示，不同性別、不同年齡段人群NASH發生率有明顯差異[5]，并推測性激素種類及其水平在NASH的性別差異中起重要作用，性別干預可能會對NASH的進展產生影響，但目前的研究結論尚存在爭議。本研究通過建立蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)飲食誘導C57BL/6雄性NASH小鼠模型[6]，觀察其血清性激素水平、肝臟病理組織學表現及相關生化指標變化，旨在探討性激素對NASH小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用14周齡C57BL/6雄性小鼠50只(購自吉林大學實驗動物中心)，常規飼養于吉林大學實驗動物中心清潔級動物房，12 h光照和黑夜循環，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%。采用隨機數字表法將50只小鼠分為對照組、MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組5組，每組10只。

1.2 方法 對照組和MCD組小鼠行假手術，睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠行睪丸切除術，恢復2 d后，對照組小鼠飼喂MCD對照飲食(Research Diets公司生產，A02082003B)，其余4組小鼠飼喂MCD飲食(Research Diets公司生產，A02082002B)，建立MCD誘導C57BL/6雄性NASH小鼠模型，自由攝取水及食物。性別干預：睪丸切除+雄激素組小鼠皮下注射丙酸睪酮(5 mg·kg-1·d-1，溶于橄欖油，Sigma公司生產，T1875)，睪丸切除+雌激素組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg·kg-1·d-1，溶于橄欖油，Sigma公司生產，E8515)。造模4周后所有小鼠禁食/水12 h，摘眼球取血，并頸椎脫臼處死。

1.3 觀察指標 (1)小鼠肝左葉固定部位取材，行HE染色及Masson染色觀察肝臟組織炎癥活動度和纖維化程度；行鋨酸染色觀察肝細胞脂肪變性情況，采用Olympus攝像系統進行觀察和攝片。(2)由兩人雙盲行病理組織學檢查，根據美國國立衛生研究院NASH臨床研究網絡病理工作組指南行非酒精性脂肪性肝病活動度評分(NAFLD activity score，NAS)[7]：①肝細胞脂肪變評分：肝實質內脂肪變肝細胞占總細胞的比例<5%計0分；5%～33%計1分；34%～66%計2分；>66%計3分。②小葉內炎癥評分：200倍光鏡下計數壞死灶，無計0分，<2個計1 分，2～4個計2分，>4個計3分。③肝細胞氣球樣變：無計0分，少見計1分，多見計2分。以上3項計分之和即為NAS總分。(3)血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平：所有小鼠摘眼球取血，置于離心管中，靜置待血液凝固后，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，取上清液，采用ELISA法測定血清睪酮、雌二醇水平(CSB-E05109m和CSB-E05098m試劑盒購自美國Cusabio公司)，采用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平。

2 結果

2.1 染色結果及NAS總分 對照組小鼠肝組織形態、結構均正常；MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠肝小葉各區肝細胞內均有大量脂肪空泡，匯管區及小葉內可見灶狀炎性細胞浸潤，以淋巴細胞浸潤為主，偶可見肝細胞氣球樣變，MCD組小鼠肝細胞脂肪變性及小葉內炎性細胞浸潤最明顯(見圖1)。5組小鼠NAS總分比較，差異有統計學意義(χ2=36.724，P=0.000)，其中MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值大于對照組，睪丸切除組、睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值小于MCD組，睪丸切除+雌激素組NAS總分秩均值小于睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平 5組小鼠血清睪酮、雌二醇、ALT、AST水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。睪丸切除組和睪丸切除+雌激素組小鼠血清睪酮水平低于對照組、MCD組、睪丸切除+雄激素組，睪丸切除+雌激素組小鼠血清雌二醇水平高于對照組、MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統計學意義(P<0.05)；MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組、睪丸切除+雌激素組小鼠血清ALT、AST水平高于對照組，睪丸切除組小鼠血清ALT、AST水平低于MCD組，睪丸切除+雌激素組小鼠血清ALT、AST水平低于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 5組小鼠NAS總分比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCD組比較，△P<0.05；與睪丸切除組比較，▲P<0.05；與睪丸切除+雄激素組比較，☆P<0.05

Table2 Comparison of serum testosterone，estradiolin，ALT and AST in the five groups

組別例數睪酮(ng/ml)雌二醇(pmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)對照組10631±081 350±044 335±50 411±52 MCD組10635±060 350±037 1094±104? 1142±68? 睪丸切除組10018±004?△☆ 339±035 953±63?△ 1042±84?△ 睪丸切除+雄激素組10621±063 339±030 1022±104? 1103±77? 睪丸切除+雌激素組10018±005?△☆2185±217?△▲☆ 753±63?△▲☆ 821±58?△▲☆ F值3862910658214441930P值0000000000000000

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCD組比較，△P<0.05；與睪丸切除組比較，▲P<0.05；與睪丸切除+雄激素組比較，☆P<0.05

圖1 5組小鼠肝臟組織染色結果(×200)

3 討論

隨著肥胖癥及代謝綜合征在全球范圍內的流行，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)迅速增長并呈低齡化發病趨勢。NAFLD包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、NASH及其相關肝硬化和肝細胞癌，NASH是NAFL向肝硬化轉化的必經階段，是隱源性肝硬化的重要原因之一。NASH預后不佳，部分患者可進一步進展為肝硬化、肝細胞癌。尋找NASH發生、發展的危險因素及阻斷其進一步進展的保護性因素，探討其防治策略是目前國內外肝病學界的研究熱點之一。

流行病學調查結果顯示，NASH在不同的年齡段人群具有不同的性別易感性，性激素種類及其水平在NASH的性別差異中起重要作用，性別干預可能會對NASH的進展產生影響，但目前的研究結論尚存在爭議。Tian等[8]對男性人群進行的研究表明雄激素與NASH無關，而Mu等[9]和Zhang等[10]在大鼠動物模型中發現雄激素對NASH有保護作用。目前關于雌激素對NASH的作用還存在較多的爭議，Kamada等[11]認為雌激素對NASH具有保護作用，而Kashireddy等[12]則認為雌激素對NASH無明顯影響，還可能是促進NASH進展的因素[13]。由于上述實驗研究是在不同的人群和/或動物模型中進行的，其發病機制不盡相同，因此所得結論也存在一定的局限性。

本研究觀察了性別干預對MCD飲食誘導C57BL/6雄性NASH小鼠的影響，研究結果顯示，睪丸切除組小鼠NAS總分秩均值小于MCD組，血清睪酮、ALT、AST水平均較MCD組降低，但睪丸切除+雄激素組小鼠與MCD組和睪丸切除組小鼠NAS總分秩均值，血清睪酮、ALT、AST水平間無差異，這與黃承飛等[14]研究結論不一致，其認為雄激素對NASH具有保護作用，分析原因可能與研究所采用的動物模型不同有關，提示雄激素在不同的NASH動物模型中的作用途徑是不同的。值得注意的是，雄性小鼠去勢后NASH病情程度有所減輕，但補充雄激素后NASH病情程度卻無明顯加重，目前其確切作用機制尚不清楚，考慮是在MCD飲食誘導NASH小鼠模型中，雄激素可能通過肝細胞脂變、炎癥等多條途徑發揮作用，是多因素參與的。本研究結果還顯示，睪丸切除+雌激素組小鼠NAS總分秩均值小于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，血清ALT、AST水平均低于MCD組、睪丸切除組、睪丸切除+雄激素組，提示雌激素可改善MCD飲食誘導C57BL/6雄性NASH小鼠病情嚴重程度，但其具體作用機制較為復雜，同樣也是多因素參與的，需在今后的研究中進一步深入分析NASH的性別差異及其機制，尋找NASH的保護性因素，不斷探討新的防治策略。

1 Adams LA，Sanderson S，Lindor KD，et al.The histological course of nonalcoholic fatty liver disease：a longitudinal study of 103 patients with sequential liver biopsies[J].J Hepatol，2005，42(1)：132-138.

2 Kashi MR，Torres DM，Harrison SA.Current and emerging therapies in nonalcoholic fatty liver disease[J].Semin Liver Dis，2008，28(4)：396-406.

3 Hashimoto E，Yatsuji S，Kaneda H，et al.The characteristics and natural history of Japanese patients with nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatol Res，2005，33(2)：72-76.

4 Sanyal AJ，Banas C，Sargeant C，et al.Similarities and differences in outcomes of cirrhosis due to nonalcoholic steatohepatitis and hepatitis C[J].Hepatology，2006，43(4)：682-689.

5 Hashimoto E，Tokushige K.Prevalence，gender，ethnic variations，and prognosis of NASH[J].J Gastroenterol，2011，46(Suppl 1)：63-69.

6 Kirsch R，Clarkson V，Shephard EG，et al.Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis：species，strain and sex difference studies[J].J Gastroenterol Hepatol，2003，18(11)：1272-1282.

7 Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology，2005，41(6)：1313-1321.

8 Tian GX，Sun Y，Pang CJ，et al.Oestradiol is a protective factor for non-alcoholic fatty liver disease in healthy men[J].Obes Rev，2012，13(4)：381-387.

9 Mu Y，She R，Zhang H，et al.Effects of estrogen and androgen deprivation on the progression of non-alcoholic steatohepatitis(NASH)in male Sprague-Dawley rats[J].Hepatol Res，2009，39(9)：910-920.

10 Zhang H，Liu Y，Wang L，et al.Differential effects of estrogen/androgen on the prevention of nonalcoholic fatty liver disease in the male rat[J].J Lipid Res，2013，54(2)：345-357.

11 Kamada Y，Kiso S，Yoshida Y，et al.Estrogen deficiency worsens steatohepatitis in mice fed high-fat and high-cholesterol diet[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2011，301(6)：G1031-1043.

12 Kashireddy PR，Rao MS.Sex differences in choline-Deficient diet-induced steatohepatitis in mice[J].Exp Biol Med(Maywood)，2004，229(2)：158-162.

13 Miyashita T，Toyoda Y，Tsuneyama K，et al.Hepatoprotective effect of tamoxifen on steatosis and non-alcoholic steatohepatitis in mouse models[J].J Toxicol Sci，2012，37(5)：931-942.

14 黃承飛，董冰.性激素對非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的保護作用研究[J].中國畜牧雜志，2008，44(23)：20-23.