廣西巴馬長(zhǎng)壽人群血清胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ水平及其影響因素分析

韋宏曠，農(nóng)清清，覃健敏，張志勇，何 敏，何灝逾，覃 健，范 譽(yù)，郭堯平

廣西巴馬是我國(guó)著名的長(zhǎng)壽地區(qū)，據(jù)2010年全國(guó)第五次人口調(diào)查顯示，100歲以上老人達(dá)到87人，90～99歲的老人達(dá)814人，其長(zhǎng)壽人口數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)其他地區(qū)。已有研究表明該地區(qū)的長(zhǎng)壽現(xiàn)象與遺傳、當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境和生活習(xí)慣等多種因素有關(guān)［1］。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ，IGF-Ⅰ)是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在機(jī)體的物質(zhì)代謝過(guò)程中起著十分重要的作用［2-3］。IGF-Ⅰ與胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體(insulin-like growth factorⅠreceptor，IGF-ⅠR)結(jié)合產(chǎn)生低血糖效應(yīng)和增加胰島素敏感性作用，而有效的胰島素反應(yīng)對(duì)人的壽命有重要影響。Horio等［4］研究表明，IGF-ⅠR基因的遺傳變異對(duì)IGF-Ⅰ表達(dá)起了重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)比較廣西巴馬長(zhǎng)壽人群與一般地區(qū)青壯年人群IGF-Ⅰ表達(dá)水平的差異，分析長(zhǎng)壽人群不同IGF-ⅠR基因型攜帶者血清IGF-Ⅰ水平的差異，探討影響長(zhǎng)壽人群血清IGF-Ⅰ水平的因素，為今后的長(zhǎng)壽機(jī)制研究提供新的線索和途徑。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2008年5月在廣西壯族自治區(qū)巴馬瑤族自治縣長(zhǎng)壽區(qū)那社、局桑、甲篆、平洞、西山鄉(xiāng)隨機(jī)抽取長(zhǎng)壽老人 (年齡90～110歲)160名作為長(zhǎng)壽組，其中男43例 (26．9%)、女117例 (73．1%)，平均年齡 (95．4±5．2)歲;同時(shí)期在廣西醫(yī)科大學(xué)體檢人群中隨機(jī)抽取健康青壯年人 (年齡20～50歲)102名作為青壯年對(duì)照組，其中男29例 (28．4%)、女73例(71．6%)，平均年齡 (39．4±9．7)歲。均經(jīng)常規(guī)體格檢查，患有腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、慢性病及其他衰老相關(guān)性疾病等不納入本研究。

1．2 方法

1．2．1 一般情況調(diào)查 制定統(tǒng)一的調(diào)查問(wèn)卷詢問(wèn)性別、年齡、民族、文化程度、病史、家族史、行為生活習(xí)慣等。

1．2．2 體格檢查 包括測(cè)量身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍，測(cè)定血壓、血糖、血脂等。血壓用血壓計(jì)測(cè)量。長(zhǎng)壽組均空腹坐位抽取肘靜脈血3 ml，不抗凝，待血液凝固后，以3 000 r/min離心10 min(離心半徑100 mm)，分離血清。總膽固醇 (TC)和三酰甘油 (TG)的檢測(cè)采用酶法，標(biāo)準(zhǔn)酶試劑盒由英國(guó)RANDOX公司提供;高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)應(yīng)用酶聯(lián)免疫一步法測(cè)定，使用日本AU400全自動(dòng)生化分析儀，生化試劑由中生北控生物科技股份有限公司提供。空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法，使用BECKHAM自動(dòng)生化儀測(cè)定。

1．2．3 血清IGF-Ⅰ水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清IGF-Ⅰ水平，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R＆D公司。操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，在450 nm處測(cè)定吸光度 (OD)值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算樣品濃度;計(jì)算濃度×5即得樣品原濃度。

1．2．4 IGF-ⅠR基因3174位點(diǎn)多態(tài)性分析 用乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝管采集長(zhǎng)壽組老人空腹外周靜脈血2 Ml，采用天根生化科技 (北京)有限公司全血DNA提取試劑盒提取基因組 DNA，保存于 -20℃。IGF-ⅠR基因3174位點(diǎn)多態(tài)性擴(kuò)增的引物序列為:上游引物5′-TCTTCTCCAGTGTACGTTCC-3′，下游引物5′-GGAACTTTCTCTTACCACATG-3′， 以 所 提 取 的DNA作為模版在設(shè)計(jì)好的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物在2．0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。取10μl PCR產(chǎn)物加入10 U限制性內(nèi)切酶MnlⅠ (美國(guó)MBI公司)，于37℃水浴消化6 h。取消化產(chǎn)物5μl，加上樣緩沖液1 μl，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察帶型。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用 (±s)表示，年齡與IGF-Ⅰ水平的關(guān)系采用直線相關(guān)分析;長(zhǎng)壽組與青壯年對(duì)照組IGF-Ⅰ水平比較采用協(xié)方差分析;長(zhǎng)壽組不同IGF-ⅠR基因型攜帶者IGF-Ⅰ水平比較采用方差分析;影響因素分析采用多元線性回歸分析，以α=0．05為納入標(biāo)準(zhǔn)，α=0．10為排除標(biāo)準(zhǔn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 長(zhǎng)壽組與青壯年對(duì)照組血清IGF-Ⅰ水平比較 長(zhǎng)壽組血清IGF-Ⅰ水平為 (114．0±31．5)μg/L，青壯年對(duì)照組為 (140．7±37．3)μg/L。直線相關(guān)分析顯示，年齡與IGF-Ⅰ水平呈負(fù)相關(guān) (r=-0．365，P＜0．001)。以年齡為協(xié)變量，對(duì)長(zhǎng)壽組與青壯年對(duì)照組IGF-Ⅰ水平作協(xié)方差分析，結(jié)果顯示，長(zhǎng)壽組IGF-Ⅰ水平低于青壯年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=6．321，P ＜0．05)。

2．2 長(zhǎng)壽組IGF-ⅠR基因3174位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果IGF-ⅠR基因3174位點(diǎn)PCR片段長(zhǎng)度為255 bp，酶切及瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)A/A基因攜帶者為132、100、23 bp共3個(gè)片段，G/G基因型為132、80、23、20 bp共4個(gè)片段，G/A基因型為132、100、80、23、20 bp共5個(gè)片段 (見(jiàn)圖1)。由于23 bp和20 bp條帶過(guò)小，在電泳圖中無(wú)法清晰顯示，但不影響基因分型分析。

應(yīng)用Hardy-Weiberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)方法，分析長(zhǎng)壽老人遺傳平衡情況，χ2檢驗(yàn)表明長(zhǎng)壽組為達(dá)到遺傳平衡的群體 (P＞0．05，見(jiàn)表1)。

表2 長(zhǎng)壽組男性和女性不同IGF-ⅠR基因型攜帶者血清IGF-Ⅰ水平比較 (±s，μg/L)Table 2 Comparison of IGF-Ⅰlevels between different IGF-ⅠR genotype carriers in longevity group

表2 長(zhǎng)壽組男性和女性不同IGF-ⅠR基因型攜帶者血清IGF-Ⅰ水平比較 (±s，μg/L)Table 2 Comparison of IGF-Ⅰlevels between different IGF-ⅠR genotype carriers in longevity group

注:IGF-Ⅰ=胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ

基因型 男性人數(shù) IGF-Ⅰ女性人數(shù) IGF-ⅠGG 15 106．3 ±41．8 48 118．0 ±26．2 GA 21 102．8 ±21．1 50 117．9 ±30．9 AA 7 108．4 ±23．8 19 117．0 ±32．5 F 1．303 2．733 P值值0．292 0．087

表3 長(zhǎng)壽組血清IGF-Ⅰ水平影響因素的多元線性回歸分析Table3 Influencing factors of serum IGF-Ⅰlevels in longevity group by multiple linear regression analysis

圖1 IGF-ⅠR基因多態(tài)性電泳圖Figure 1 Electrophoreticmap of IGF-ⅠR genetic polymorphism

表1 長(zhǎng)壽組Hardy-Weiberg遺傳平衡檢驗(yàn)Table 1 The Hardy-Weinberg equilibrium test in longevity group

2．3 長(zhǎng)壽組不同IGF-ⅠR基因型攜帶者血清IGF-Ⅰ水平比較 長(zhǎng)壽組中，GG、GA和AA基因型攜帶者血清IGF-Ⅰ水平分別為 (115．3 ±30．4)μg/L、 (112．1±34．5)μg/L 及 (113．2 ±27．3)μg/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=1．030，P=0．386)。按性別分層，男性和女性3種基因型攜帶者的IGF-Ⅰ水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05，見(jiàn)表2)。

2．4 長(zhǎng)壽組血清IGF-Ⅰ水平的影響因素分析 以血清IGF-Ⅰ作為因變量，將性別、年齡、民族、體質(zhì)指數(shù)、臀圍、腰 圍、血 壓、血 糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C作為自變量帶入多元線性回歸模型，以α=0．05為納入標(biāo)準(zhǔn)，α=0．10為排除標(biāo)準(zhǔn)。采用逐步法篩選變量后，體質(zhì)指數(shù)和HDL-C進(jìn)入回歸模型 (見(jiàn)表3)。

3 討論

IGF-Ⅰ是結(jié)構(gòu)和功能與胰島素類似的多肽生長(zhǎng)因子，IGF-Ⅰ缺乏可引起多種疾病，尤其對(duì)于老年人可引起心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病［5］。IGF-Ⅰ可以通過(guò)與其受體結(jié)合，發(fā)揮與胰島素類似的生理作用，并可降低生長(zhǎng)激素水平，調(diào)節(jié)胰島素受體等途徑增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，從而增加血糖攝取、利用。本研究發(fā)現(xiàn)，年齡與IGF-Ⅰ水平呈負(fù)相關(guān)，即隨著年齡的增長(zhǎng)，IGF-Ⅰ水平下降。長(zhǎng)壽組IGF-Ⅰ水平低于青壯年對(duì)照組，提示廣西巴馬縣人群長(zhǎng)壽與其血清IGF-Ⅰ水平較低可能有一定的關(guān)系。研究顯示長(zhǎng)壽老人血清IGF-Ⅰ水平較一般人群降低［6］，另外對(duì)哺乳動(dòng)物的研究也顯示血清IGF-Ⅰ水平降低與延長(zhǎng)生命壽限有關(guān)［7］。

有研究顯示在長(zhǎng)壽老人中IGF-ⅠR基因突變與血清IGF-Ⅰ水平和IGF-ⅠR活性減低有關(guān)［8］。Albani等［6］報(bào)道，在IGF-ⅠR基因位點(diǎn)3174的G/A多態(tài)性對(duì)血漿IGF-Ⅰ水平有影響，IGF-ⅠR A+(GA和AA基因型)攜帶者的血漿IGF-Ⅰ水平較A-(GG型)攜帶者低。而本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)壽人群不同IGF-ⅠR基因型攜帶者的IGF-Ⅰ水平并無(wú)差異。IGF-ⅠR基因位點(diǎn)3174的G/A變異是一種同義突變，不影響其蛋白產(chǎn)物。亦有研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)血清IGF-Ⅰ水平的影響可能通過(guò)與IGF-ⅠR或其他基因上一種或多種功能性突變的相互作用而實(shí)現(xiàn)［6］。此外，IGF-Ⅰ結(jié)合蛋白、生長(zhǎng)激素及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等也是對(duì)血清IGF-Ⅰ水平影響較大的因素［9］，也可能這些因素的影響大于基因的作用。IGF-ⅠR基因多態(tài)性與血清IGF-Ⅰ水平之間的關(guān)系，仍有待進(jìn)一步深入研究。長(zhǎng)壽組血清IGF-Ⅰ水平影響因素的多元線性回歸分析顯示，長(zhǎng)壽老人體質(zhì)指數(shù)、血清HDL-C水平與血清IGF-Ⅰ水平呈正相關(guān)。有研究報(bào)道長(zhǎng)壽老人的體質(zhì)指數(shù)與血脂異常呈正相關(guān)［10-11］，長(zhǎng)壽老人體質(zhì)指數(shù)與血清IGF-Ⅰ水平變化呈正相關(guān)可能與血脂異常有關(guān)。而血清IGF-Ⅰ水平與血清HDL-C水平呈正相關(guān)，說(shuō)明血清IGF-Ⅰ水平變化可能影響血清HDL-C水平，可能與血清IGF-Ⅰ參與血脂代謝有關(guān)，這與相關(guān)研究一致［12］。此外，本研究中長(zhǎng)壽老人血清IGF-Ⅰ水平與血糖水平無(wú)相關(guān)性，而對(duì)54周齡大鼠建立2型糖尿病模型研究，結(jié)果顯示血清IGF-Ⅰ表達(dá)與血糖呈負(fù)相關(guān)［13］，這可能與該地區(qū)長(zhǎng)壽老人的血糖異常檢出率較低有關(guān)［14］。

綜上所述，廣西巴馬長(zhǎng)壽人群血清IGF-Ⅰ水平明顯低于青壯年人。長(zhǎng)壽人群IGF-ⅠR基因3174位點(diǎn)多態(tài)性可能對(duì)其血清IGF-Ⅰ表達(dá)無(wú)影響，血清IGF-Ⅰ水平與體質(zhì)指數(shù)及血清HDL-C水平呈正相關(guān)，提示血清IGF-Ⅰ的變化可能會(huì)影響血清HDL-C的水平。本研究結(jié)果為今后的長(zhǎng)壽研究及開(kāi)發(fā)抗衰老藥物提供新的線索和途徑，但由于本研究樣本量較小，對(duì)于長(zhǎng)壽人群血清IGF-Ⅰ水平的影響因素仍有待于在更大樣本的人群中進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。

1 黎湘娟，張志勇，容敏華，等．ApoB基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用與廣西巴馬縣長(zhǎng)壽的相關(guān)性研究［J］．環(huán)境與健康雜志，2011，28(3):202-205．

2 彭珊璐，馮國(guó)祝，王國(guó)香，等．新生兒缺氧缺血性腦病血清胰島素樣生長(zhǎng)因子-1測(cè)定的意義 ［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2012，20(4):601．

3 劉潤(rùn)萍，孫麗莎，陳秋．胰島素樣生長(zhǎng)因子-1與糖尿病合并骨質(zhì)疏松的關(guān)系研究進(jìn)展［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，16(1):237．

4 Horio T，Kamide K，Takiuchi S，et al．Association of insulin-like growth factor-1 receptor gene polymorphisms with left ventricular mass and geometry in essential hypertension ［J］．JHum Hypertens，2010，24(5):320-326．

5 Puche JE，Castilla-Cortázar I．Human conditions of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ)deficiency［J］．J Transl Med，2012，10:224．

6 Albani D，Batelli S，Polito L，et al．A polymorphic variant of the insulin-like growth factor 1(IGF-1)receptor correlates with male longevity in the Italian population:a genetic study and evaluation of circulating IGF-1 from the"Treviso Longeva(TRELONG)"study ［J］．BMC Geriatr，2009，9:19．

7 Bartke A．Impact of reduced insulin‐ like growth factor‐ 1/insulin signaling on aging in mammals:novel findings ［J］．Aging cell，2008，7(3):285-290．

8 Suh Y，Atzmon G，Cho MO，et al．Functionally significant insulinlike growth factorⅠ receptormutations in centenarians［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2008，105(9):3438-3442．

9 吳田英，王麗珍，古桂雄．胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ研究與進(jìn)展［J］．中國(guó)兒童保健雜志，2008，16(3):320-322．

10 農(nóng)清清，張志勇，何敏，等．廣西巴馬長(zhǎng)壽區(qū)與非長(zhǎng)壽區(qū)人群血脂水平及其影響因素 ［J］．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(1):1-3．

11 楊啟嶺，買(mǎi)蘇木，阿迪拉，等．新疆和田地區(qū)居民長(zhǎng)壽原因的十年隨訪研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(1):148．

12 Arai Y，Kojima T，Takayama M，et al．The metabolic syndrome，IGF-1，and insulin action ［J］．Mol Cell Endocrinol，2009，299(1):124-128．

13 Kim SJ，Ju A，Lim SG，et al．Chronic alcohol consumption，type 2 diabetesmellitus，insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ)，and growth hormone(GH)in ethanol-treated diabetic rats ［J］．Life Sci，2013，93(21):778-782．

14 王潔，呂澤平，胡才友，等．廣西巴馬地區(qū)壯族長(zhǎng)壽家系血糖狀況分析［J］．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(1):55-57．