參附湯入血有效成分對急性心衰大鼠血流動力學(xué)及心肌凋亡、自噬的影響*

周俊佟，雷 雪,王雪梅,劉 佳,付殿斌,李麗靜

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

參附湯是療效確切的中醫(yī)名方，出自于明代醫(yī)家薛己《正體類要》，為溫里劑中回陽救逆的代表方劑，由炮附子、人參組成，具有益氣回陽固脫功效，用于陽氣暴脫證，癥見四肢厥逆、冷汗淋漓、呼吸微弱、脈微欲絕等。現(xiàn)已開發(fā)研究出參附注射液廣泛應(yīng)用于臨床。本文通過對比參附湯有效活性成分的萃取液和參附湯水煎液對急性心衰大鼠血流動力學(xué)影響的區(qū)別，來推斷參附湯在體內(nèi)發(fā)揮作用的主要成分。通過采用實時熒光定量PCR檢測心肌凋亡與自噬，推斷參附湯對心臟組織的作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 動物

雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號SCXK(吉)-2011-0004)。

1.2 藥品及儀器

參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z51020664，10 ml×5)。異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，2 ml∶1 mg)、參附湯水煎萃取液、MP-150 16道生理記錄儀(美國Biopac公司)、熒光定量PCR儀(美國Stratagene產(chǎn)品)。Beclin-1引物序列，β-actin，Caspase-3引物，SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒，為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 參附湯入血有效成分對急性心衰大鼠血流動力學(xué)的影響

雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、陽性對照組、參附湯給藥組、參附湯萃取液給藥組各10只。空白對照組腹腔注射4 ml/kg生理鹽水，陽性組腹腔注射6 ml/kg的參附注射液，參附湯給藥組灌胃給予2 ml/100 g參附湯水煎液，參附湯萃取液給藥組灌胃給予2 ml/100 g參附湯萃取液；除空白組外，其他各組均腹腔注射4 ml/kg的異丙腎上腺素，連續(xù)給藥5 d。第5天給藥后，參照孫成文[1]心衰模型制備方法,用1.2 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉,將動物固定于手術(shù)臺上分離右側(cè)頸總動脈,經(jīng)頸總動脈插管入左心室,以測左室內(nèi)壓(LVSP),經(jīng)多道生理記錄儀微分計算左室上升最大速率(+dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)，四肢皮下埋入針式電極觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖，分別記錄0、5、15、25、30 min LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等。

2.2 參附湯入血有效成分對急性心衰大鼠心肌凋亡、自噬的影響

實時熒光定量PCR檢測心肌凋亡、自噬。參照文獻(xiàn)報道的引物序列: Beclin1引物序列：上游5’GGCA GTGGCTCCTATT-3’，下游：5’-GGCGTGCTGTGCTCTGAAAA-3’；Atg5引物序列:上游5’-AGTGGAGGCAACAGAACC-3’,下游5’-GACACG AACTGGCAC ATT-3’； Caspase-3引物序列:上游：5-GCTGGACTGCGGTATTGAG-3’，下游：5’ -CCTGGAACATCGGATTTGATT-3’；β-actin作為對照,引物序列: 上游引物為5’-CTG TAT GCC TCT GGT CGT AC-3’，下游：5’-TGA TGT CAC GCA TTT CC-3’，產(chǎn)物為470 bp。取50 mg心肌組織,用RNA試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在TaqDNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃40 s,60℃40 s,72℃1 min共35個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。

3 結(jié)果

3.1 對左心室收縮壓的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓明顯降低(P<0.01),與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 01)，陽性組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 給藥后對急性心衰大鼠LVSP的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

3.2 對左心室內(nèi)壓最大上升速率的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓最大上升速率有明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 01)，陽性組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 對左心室內(nèi)壓最大下降速率的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓最大上升速率有明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陽性組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，與模型組比較參附湯水煎液組、參附湯萃取液組與陽性對照組Caspase mRNA的表達(dá)量均明顯下降， 與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

3.5 自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，與模型組比較參附湯水煎液組、參附湯萃取液組與陽性對照組Beclin1、Atg5 mRNA的表達(dá)量均明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 給藥后對dp/dt max 相對變化率的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表3 給藥后對dp/dt min相對變化率的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表4 參附湯對Caspase mRNA，Beclin1、Atg5 mRNA的表達(dá)量影響

4 討論

研究表明，參附湯血中移行成分可保護(hù)缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用[3]；參附湯及其血中移行成分對大鼠急性心衰具有一定的治療作用，并能調(diào)整心臟的能量代謝[4]。LVSP在一定程度上可以反映心肌收縮力;左心室壓力最大上升速率+dp/dtmax對變力性因素均高度敏感,反映心肌收縮成分的縮短最大速度,為此在評價收縮性能急性改變時是較好的測量指標(biāo);與此對應(yīng)的左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)，反映心肌舒張時心肌纖維延長的最大速度,二者是評價心肌收縮、舒張性能的常用指標(biāo)[2]。當(dāng)心功能不全時,這些指標(biāo)就會降低[5]。本研究采用異丙腎上腺素急性心衰模型并加以改良，該方法操作簡便、穩(wěn)定，與臨床心衰病理生理機(jī)制與臨床有相似之處，造模后dp/dtmax顯著下降，且在正常值的20%～40%形成嚴(yán)重的心衰模型，模型組與空白組比較左心室內(nèi)壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率及左心室內(nèi)壓最大下降速率有明顯降低，說明模型成立；參附湯水煎液組、參附湯萃取液組、陽性組與模型組比較，左心室內(nèi)壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率及左心室內(nèi)壓最大下降速率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。參附湯入血有效成分對急性心衰大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)有明顯的改善作用,且參附湯水煎液與參附湯萃取液給藥后改善作用比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明了參附湯入血有效成分與萃取液中成分基本一致。caspase-3是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用[6]。Beclin1 是自噬體 (autophagosome) 形成過程中的一個必需分子，它能夠介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡(phagophore)，從而調(diào)控哺乳動物自噬體形成與成熟。在自噬過程中 Beclin1 的表達(dá)水平往往會上升[7]，自噬相關(guān)基因-5編碼的蛋白Atg5在自噬體的形成過程中參與泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)的形成,對整個自噬過程都有極其重要的作用[8]。本實驗通過實時熒光定量PCR檢測心肌凋亡與自噬相關(guān)基因，結(jié)果表明參附湯入血有效成分可保護(hù)急性心衰大鼠心肌細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用，且與降低Beclin-1、Atg5 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量有關(guān)。

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