干預循環腫瘤細胞對小細胞肺癌療效的影響研究

楊 政，劉春花，李 晶，馬曉平，黃 偉，鞏 平

肺癌居世界大部分國家腫瘤死亡原因的首位[1]，其中小細胞肺癌(SCLC)占10%～15%。目前,針對SCLC的治療以化療或化放療以及支持治療為主，而SCLC對化療易產生耐藥、易復發、預后差[2]，近20年來，SCLC的預后改善甚微[3]，中晚期SCLC仍被認為是難以治愈的。目前對SCLC療效的評估主要由腫瘤標志物及影像學變化評定[4]，而這些方法有報道顯示不夠精確[5]，因為沒有好的評估療效指標和復發預測值，臨床上常存在過度用藥和延誤治療的雙重風險，無法保證患者獲益，故而尋找有效的療效監測方法具有重要意義。循環腫瘤細胞(CTCs)是指自發或者由于診療操作而引入外周血的腫瘤細胞，近年來也發現了CTCs以循環腫瘤細胞微栓(CTM)的方式存在，且認為CTM對預后的影響更大[6]。與以反映增殖為主的實體瘤的療效評價標準(RECIST)評估方法相比，CTCs更能反映腫瘤轉移和侵襲，而轉移和侵襲對腫瘤的預后影響更大[5，7]。因此CTCs被認為是最具有臨床應用潛力的新型細胞學標志。在非小細胞肺癌(NSCLC)和SCLC中，CTCs均已經被報道是與影像學及腫瘤標記物無關的獨立預后因素[8-9]。但SCLC較NSCLC更易復發，且CTCs數量明顯較NSCLC多[10]，這提示在SCLC中CTCs可能有不同于NSCLC的生物學特點。理論上，干預獨立的預后影響因素如CTCs的數量，會影響到SCLC的預后。本研究通過采用原發灶的病理學標記進行個體化的檢測和個體化的干預CTCs，評價其對于短期療效的影響，從而為SCLC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2013年6月石河子大學醫學院第一附屬醫院收治的45例SCLC患者為研究對象，入組標準為：年齡≥18周歲，Karnofsky功能狀態評分(KPS)≥70分，預期壽命>3個月，受試前血常規、肝腎功能、心電圖檢查結果無異常，依從性好。采用隨機數字表法分為對照組(23例)和試驗組(22例)，2組患者性別、年齡、分期、治療前KPS、TNM 分期比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。患者均自愿簽署知情同意書。本研究已得到石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，并在世界衛生組織國際臨床試驗注冊平臺http://www.chictr.org/注冊。由于CTCs采集方法的特殊性，試驗采用邊募集受試者邊試驗的方式進行。設置雙盲對照試驗的方法為：試驗組和對照組在同一病區治療，彼此信息不對稱；揭盲原則包括：某一組出現明顯的優良預后指征或者出現嚴重的毒副作用。

1.2 治療方案 兩組患者均按照美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南指導的化療方案，使用常規化療藥物治療，于首次化療前及化療周期結束后檢測外周血CTCs，每2個化療周期后進行全面檢查及療效評估：對照組根據影像學和血清學評估結果(RECIST評價[4])決定繼續按原方案治療或者更換治療方案，完全緩解(CR)：所有目標病灶消失，部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小30%，無變化(SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達進展(PD)，PD：基線病灶長徑總和增加20%或出現新病灶。試驗組根據CTCs檢測結果決定按原方案治療或更換治療方案，本課題參考RECIST的評價原理將CTCs數目評價療效定為7.5 ml。外周血中CTCs數目全部消失為CR，減少超過30%為PR，上升>25%為PD，介于PR和PD之間為SD[4]。更換的方案治療參考NCCN-SCLC部分并結合臨床醫師的判斷。如某次檢測CTCs為0且無影像學表現，即暫不行治療。共進行4個周期化療，2組化療藥物均主要為鉑類和依托泊苷，根據指南進展后改為吉西他濱單藥。

本研究創新點：

干預循環腫瘤細胞(CTCs)的研究屬于前沿領域，目前有關其研究的國內外報道較少。本課題在小細胞肺癌(SCLC)實施CTCs的臨床干預和動態監測，進一步探討動態監測CTCs在SCLC的臨床治療和發現早期轉移中的重要意義，為腫瘤個體化治療提供有力的臨床依據。隨著腫瘤患病率的不斷增長，早期發現腫瘤的復發轉移和減少化療藥使用的盲目性對于腫瘤的治療至關重要，在腫瘤近期療效的判定方面，初步探索了一種從以往瘤灶水平突破到細胞水平的評效方式。強調患者的主體地位，重視用藥時機的合理化。在決定是否進行原方案化療時，初步探索了一種擺脫以往忽視患者個體隨時變化的給藥時機，及時和靈活地掌控患者的腫瘤負荷水平，調整用藥方式，本研究在提高SCLC的早期診斷和合理化治療方面得到了突破。

1.3 療效及毒副作用評價 治療2個周期后，45例SCLC患者進行CTCs數目評價和RECIST評價療效；治療4個周期后，評價兩組療效及客觀緩解率(ORR)、疾病控制率(DCR)，ORR=CR+PR,DCR=CR+PR+SD；隨訪3個周期后，采用KPS評定生活質量。

1.4 CTCs的檢測

1.4.1 主要試劑及儀器 免疫磁珠分選系統MiniMACS Starting Kit，德國Meltenyi Biotec公司；Pan-Keratin(C11) Mouse mAb抗體，美國Cell Signaling Technology公司；流式細胞儀FACS Calibur Ⅲ型，美國BD公司；Ficoll人類密度梯度淋巴細胞分離液，北京索萊寶生物公司；異硫氰酸熒光素(fluoresce in isothiocyanate,FITC)標記山羊抗小鼠IgG流式二抗，北京中杉金橋公司；CD56抗體，北京中杉金橋公司。

表1 2組一般資料比較Table 1 Comparison of general informations between the two groups

注：KPS=Karnofsky功能狀態評分；*為t值

1.4.2 確定每例標本的病理標志資料 從病理科資料庫調取患者病理或活檢時保存的多種標志連續染色片，在對于SCLC診斷意義較大的AE1/3、CD56、TTF-1、CgA 4種抗體中選擇陽性率最高者并記錄[11]。

1.4.3 標本采集 嚴格消毒后，應用真空采血針采取肘正中靜脈血，棄去穿刺后的前2 ml靜脈血，采集此后的7.5 ml靜脈血。所有血樣均加入肝素抗凝混勻，并在采集后24 h內進行CTCs富集。

1.4.4 CTCs的富集及鑒定 Ficoll密度梯度離心法富集單個核細胞，免疫磁珠陰性分選，流式細胞技術陽性分選及分析，免疫組化染色鑒定CTCs。各步驟的操作過程遵循廠商規定的技術標準。

1.5 CTCs陽性標準 細胞體積>16 μm，核質比大于50%，核異性型，核染色質濃染。在試驗流程標準下，絕大部分紅細胞、血小板及淋巴細胞可被排除。

1.6 隨訪 隨訪方式以病例跟蹤、門診復查、電話約診為主，以患者疾病確診時間為隨訪起始時間。將失訪病例最后一次隨訪按PD計算。

2 結果

2.1 CTCs檢出情況 45例SCLC患者首次CTCs檢出37例，陽性率為82%。其中對照組20例(87%)，試驗組17例(77%)，差異無統計學意義(χ2=0.721，P=0.396)。

2.2 兩種療效評價方式評價SCLC患者療效的結果 治療2個周期后，45例SCLC患者CTCs變化評價和RECIST評價的療效比較，差異有統計學意義(u=12.210，P=0.011，見表2)。

2.3 治療后兩組治療效果比較 治療4個周期后，對照組與試驗組療效及ORR、DCR比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 兩種療效評價方式評價SCLC患者療效的結果(例)Table 2 Evaluation of curative effect using two evaluation methods in SCLC patients

注：CR=完全緩解，PR=部分緩解，SD=無變化，PD=進展

表3 兩組治療效果比較(例)Table 3 Comparison of efficacy between the two groups

注：ORR=客觀緩解率，DCR=疾病控制率；*為χ2值

2.4 兩組患者KPS比較 隨訪3個周期后，對照組KPS為(82.1±1.3)分，試驗組為(81.1±1.0)分，差異無統計學意義(t=1.588，P=0.214)。

3 討論

腫瘤轉移占致死原因的90%[12]，根據經典腫瘤學理論：侵襲、脫落入血是轉移的最初階段[13-14]。一系列文獻報道表明，通過CTCs數目可以預測SCLC患者的化療療效[15]，CTCs能反映患者病情的微觀變化和腫瘤轉移的特征，一定程度上反映腫瘤的轉移存活率和新宿組織定植能力。而影像學浸潤主要反映腫瘤的原位增殖和營養供應情況，并不一定反映腫瘤的轉移能力。有研究報道，乳腺癌中CTCs的變化和影像學的變化無任何關聯[16]。并有研究報道，CTCs的變化僅與NSCLC的影像學變化相關，與SCLC的影像學變化無關[17]。本研究45例SCLC患者完成2個周期化療后按CTCs數目及RECIST做療效評價，結果提示兩種評效方法有差異，CTCs數目變化與RECIST評價臨床療效不同步。支持了以往的研究結論。因此，將全程干預CTCs數目減少作為治療和用藥的導向，相對于以控制影像學進展作為治療目標的方法，給予腫瘤細胞更充分、游離的藥物接觸環境，更有可能在一定程度上延緩腫瘤的迅速轉移。腫瘤患者的預后受多種因素的影響，少量的CTCs在腫瘤新宿組織定植后，其增生及微環境情況如“Niche”[18]對化療藥物會產生更強的抵抗力。本研究結果顯示，試驗組與對照組患者的ORR和DCR不同，這種現象是否是因為CTCs具有同樣的化療藥物抵抗性而降低了新療法的獲益效能，其原因有待進一步探索。試驗組與對照組治療后KPS無差異，提示合理的使用化療干預CTCs，不會增加患者毒副作用和影響生活質量，目前還沒有證據表明在不改變給藥方式和劑量的情況下單以改變常規化療藥物的給藥時機會造成患者毒副作用增加及生活質量的下降。

以往捕獲CTCs的研究中，反復的離心，轉移以及流式細胞技術造成了CTCs數目的丟失和死亡。為了擴展CTCs的臨床用途和提高檢測率，Matthew等[19]發展了基于細胞大小和變形性的手段，捕獲了CTCs，并且證實了潛在的體外培養特性及初步檢驗了其對化療藥物的敏感性。Matthew等[19]將CTCs植入了小鼠體內，CTCs成功地存活和增殖，進一步證實了CTCs在腫瘤轉移和增殖過程中的意義。盡管CTCs的檢測存在很大的挑戰，探索以細胞增殖和生長規律為核心的CTCs細胞生物學研究也存在著很多未知。而且CTCs的異質性尚有待腫瘤學其他研究領域的進一步發展。但關于CTCs的研究給腫瘤臨床治療指引了一種新的方向：在腫瘤開始轉移之前，靶向于CTCs的治療很有可能改善腫瘤的預后。

SCLC是一種發病率較低的癌種，本課題由于受到倫理學的限制和模型疾病發病率的限制，未能開展大規模、長時間的隨訪，因此尚無法得出多中心、大樣本的數據。今后應開展多中心合作，并繼續對受試者的無進展生存期(PFS)及總生存期(OS)做出探究，以期得出更加中肯的結論。

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