食管鱗狀細胞癌患者血漿miR-200c和miR-155的表達水平及其臨床意義

周明霞，賀 靖，孫 麗，尹惠卿

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25 nt的內源性單鏈RNA，可通過降解靶mRNA或抑制其翻譯過程來負向調控基因的表達和蛋白的合成，參與多種病理、生理過程[1]。有研究顯示，在不同疾病及病理狀態下一些miRNA的改變可穩定、特異地反映在血清或血漿中[1-2]。可通過分子生物學方法進行擴增及測定，并作為生物標志物用于多種疾病的診斷和預后判斷[3-4]。研究顯示，miR-200c在食管鱗狀細胞癌(ESCC)的癌組織中表達升高，高表達的miR-200c與患者化療抵抗相關[5]。miR-155作為炎癥相關的miRNA，可參與多種腫瘤及心血管疾病的發生發展[6-8]。本研究旨在觀察ESCC患者血漿miR-200c和miR-155的表達水平，探討二者在ESCC臨床診療中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9月—2013年5月在鄭州大學第一附屬醫院確診為ESCC的患者33例(ESCC組)，均符合《病理學》第7版中ESCC診斷標準。其中男18例，女15例；平均年齡(60.9±9.0)歲；吸煙10例(30.3%)；病理分期(參照1976年全國食管癌工作會議制定的臨床病理分期標準)：Ⅰ期5例(15.2%)，Ⅱ期18例(54.5%)，Ⅲ期10例(30.3%)；分化程度：低分化6例(18.2%)，中分化24例(72.7%)，高分化3例(9.1%)；13例(39.4%)發生轉移；21例(63.6%)為術前，12例(36.4%)為術后。

1.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑TRI Reagent BD(美國MRC Gene公司)；RT反轉錄試劑盒、實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(日本TAKARA公司)；NanoDrop 2000c紫外分光光度計(美國賽默飛世爾公司)；7500 Fast型qRT-PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 方法 ESCC患者于入院后次日采集晨時空腹12 h以上的肘靜脈血3 ml置于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，3 000×g離心10 min，將血漿轉移至1.5 ml EP管中，再以12 000×g離心10 min，取200 μl血漿，用TRI Reagent BD試劑提取總RNA。NanoDrop 2000c紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。選取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1的樣品用于后續試驗。按RT反轉錄試劑盒說明書操作將RNA反轉錄為cDNA。引物設計與合成由廣州銳博生物科技有限公司完成。qRT-PCR總反應體系為20 μl[9]，包括SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA模板2 μl，雙蒸水(ddH2O)6 μl。循環參數：95 ℃ 30 s,95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。以U6為內參基因；用7500 Fast System SDS軟件計算Ct值。血漿miR-200c和miR-155的相對表達量用2-ΔΔCt法計算[10]。

本研究創新點：

本研究檢測了食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者血漿miR-200c和miR-155的表達水平及其臨床意義，以血漿標本代替腫瘤組織標本，取材容易，檢測方便，更有助于臨床研究，可為ESCC的診斷提供新的生物標志物。

2 結果

2.1 血漿miR-200c和miR-155的表達水平 對照組和ESCC組受檢者血漿miR-200c、miR-155表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組受檢者血漿miR-200c和miR-155的表達水平比較Table 1 Comparison of the expression levels of miR-200c and miR-155 between the two groups

2.2 血漿miR-200c和miR-155在ESCC診斷中的價值 所有受檢者ROC曲線分析顯示，血漿miR-200c和miR-155診斷ESCC的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.853〔95%CI(0.774，0.931)和0.771〔95%CI(0.674，0.867)；以Youden指數最大化作為選擇依據，則血漿miR-200c和miR-155診斷ESCC患者的最佳分界值分別為4.17(靈敏度為79%，特異度為88%)和2.89(靈敏度為69%，特異度為81%)(見圖1、2)。

2.3 血漿miR-200c、miR-155水平與臨床病理指標的關系 ESCC患者血漿miR-200c水平與病理分期及是否轉移有關，差異有統計學意義(P<0.05)；而與性別、年齡、分化程度、是否手術無關，差異無統計學意義(P>0.05)。ESCC患者血漿miR-155水平與各臨床病理指標均無關，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

圖1 血漿miR-200c診斷ESCC的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve of plasma miR-200c to discriminate the ESCC

圖2 血漿miR-155診斷ESCC的ROC曲線分析Figure 2 ROC curve of plasma miR-155 to discriminate the ESCC

表2 ESCC組miR-200c、miR-155水平與臨床病理指標間的關系(n=33)Table 2 Correlation between plasma miR-200c，miR-155 and clinical pathological indicators in ESCC group

注：*為F值

3 討論

miRNA是一類由非編碼區轉錄產生的單鏈小分子RNA，由于其廣泛存在于動植物中，并可通過對相應靶基因的調控參與眾多病理、生理過程，自1993年由Lee等首次報道后，迅速成為眾多領域的研究熱點。大量試驗表明，miRNA在不同疾病及病理進程中具有特定的表達譜，并可穩定表達于外周循環血中，這些特點使miRNA可作為腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等多種疾病診斷及預后有力的生物標志物[1-4]。

食管腫瘤為我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來雖然其診斷與治療有了較大的進展，但其發病率仍居高不下，5年生存率仍較低。ESCC又是食管腫瘤中最常見的病理類型，由于其惡性程度高，治療效果差，嚴重威脅人們的健康，一直是關注和研究的焦點。而miRNA類內源性因子在ESCC中的作用及機制尚未系統闡明。已有研究顯示，多種miRNA與ESCC發生、發展及預后相關，如miR-21、miR-146a等[11-13]。但ESCC患者循環miRNA表達譜的變化及其作為ESCC診療及預后評估價值的研究較少。Hamano等[5]發現食管癌組織中miR-200c表達升高，高表達的miR-200c預示著較短的生存期，并且發現miR-200c可通過抑制其靶基因PPP2R1B的表達進而激活Akt信號通路，參與癌細胞對化療藥物的抵抗。miR-155是炎癥相關的miRNA，已有研究證明miR-155參與了多種腫瘤的發生、發展及轉移等[14-16]。本研究采用qRT-PCR檢測ESCC患者血漿miR-200c、miR-155的表達水平，發現ESCC患者血漿miR-200c、miR-155水平高于健康者；ROC曲線分析顯示，血漿miR-200c以0.853的AUC將ESCC與健康者區分開，最佳臨界點的靈敏度為79%，特異度為88%；血漿miR-155以0.771的AUC 將ESCC與健康者區分開，最佳臨界點的靈敏度為69%，特異度為81%。ESCC患者血漿miR-200c水平與性別、年齡、分化程度、是否手術無關，但與腫瘤的病理分期及是否轉移有關；血漿miR-155水平與所收集的各臨床病理指標均無關，提示miR-200c可能參與了ESCC的病理進程，可作為ESCC患者病情監測及預后的生物標志物。但目前miR-200c、miR-155參與ESCC發生、發展的觀點尚缺乏直接證據，還需進一步研究。

本研究的意義在于發現ESCC患者血漿miR-200c、miR-155水平升高，以血漿標本代替腫瘤組織標本更便于臨床研究；發現了ESCC診斷及病情評估的新生化指標，并有可能成為未來ESCC防治的新突破點，為進一步研究miR-200c、miR-155在ESCC臨床診療中的價值提供了理論基礎。但本研究尚存在許多局限性，如樣本量不足，ESCC并發癥對試驗結果的影響等；且本研究中ESCC患者的基礎病如糖尿病、高血壓等是否會對血漿miR-200c、miR-155水平產生影響尚不清楚，需要擴大樣本量進一步評估血漿miR-200c、miR-155作為ESCC診斷及病情評估生物標志物的意義和價值。

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