流式細胞術和血栓彈力圖檢測對冠心病經皮冠狀動脈介入術后氯吡格雷的反應性評估

趙 燕，楊 明，金 新，馬 杰，崔建英，賈 曉，高 亢，孫一光

氯吡格雷聯合阿司匹林雙重抗血小板治療是目前急性冠脈綜合征和冠心病患者經皮冠狀動脈介入術(PCI)后的常規治療方案。但部分患者即使接受常規抗血小板治療，臨床上仍不能有效防止血栓事件的發生，且不能有效抑制血小板聚集。其主要原因與氯吡格雷低反應性有關。如何監測血小板功能，進行有效的危險分層和預后評估，進而實行抗血小板藥物的個體化治療已成為臨床亟待解決的問題。流式細胞術是目前常用且較穩定的實驗室血小板功能檢測方法，PAC-1 和CD62p是主要的血小板受體活化標志物。CD62p的增加并不會隨著時間的延長而發生逆轉,因此其被認為是血小板功能檢測的“金標準”[1]。流式細胞術靈敏度、特異度、準確度均較高,但是費用昂貴、操作復雜，臨床適用性不高。血栓彈力圖(TEG)是一種從凝血、血小板聚集、纖溶等方面動態監測凝血全過程的床旁快速血小板功能檢測方法。隨著臨床TEG在抗血小板聚集藥物療效監測中的應用，其對缺血事件的預測價值已得到證實，臨床上常以二磷酸腺苷(ADP)抑制率評估氯吡格雷的反應性。本研究以流式細胞術為參考標準評估血小板功能，同時應用TEG檢測的ADP抑制率評估氯吡格雷抗血小板聚集的治療效果，經過1年的臨床隨訪，探討流式細胞術和TEG檢測對氯吡格雷反應性的評估價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選2011年2—12月首都醫科大學附屬復興醫院心內科收治住院，診斷為冠心病并行PCI，且術后行常規抗血小板治療并同意參與本研究的患者89例作為觀察組，其中男54例，女35例；年齡(67.8±11.2)歲。同時選取該院同期體檢健康者29例作為對照組，其中男16例，女13例；年齡(48.3±6.6)歲。排除標準：既往有出血病史者；正在使用華法林或肝素抗凝治療者；正在服用非甾體類抗炎藥物者；肝功能不全〔門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT) 檢測>參考值(40 U/L)2倍以上〕者；腎功能不全(肌酐>140 μmol/L)者；患風濕性疾病者；血小板計數<80×109/L或>450×109/L者；腫瘤或血液系統疾病者。兩組的性別構成、年齡比較，差異無統計學意義(χ2= 0.754,t=0.421，P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查 患者入院即刻抽取肘靜脈血查白細胞計數(WBC)、血小板計數(PLT)、血紅蛋白(Hb)、血糖(GLU)、血鉀(K)、血鈉(Na)、血氯(Cl)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血尿酸(UA)、血腦利鈉肽(BNP)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(Fgb)，記錄并錄入數據庫。

1.2.2 治療方法 觀察組患者在術后堅持服用冠心病二級預防藥物，抗血小板藥物聯合應用阿司匹林100 mg (1次/d)和氯吡格雷75 mg(1次/d)。

1.2.3 CD62p及PAC-1的檢測 患者均在行冠狀動脈造影PCI后第7天晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml置于109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管(美國BD公司)中，并取5 μl血分別加入事先置有單抗(美國BD公司產)的塑料管內，其中對照管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE各20 μl，實驗管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE、CD62-PE各20 μl。兩管均室溫避光反應20 min，每管分別加入1 ml含1%多聚甲醛的PCS固定20 min，置于4 ℃冰箱保存，并于24 h內應用流式細胞儀(美國Becton Dickin公司)檢測血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表達率〔CD62p(GMP·140)、PAC-1檢測均用5 μmol/L二磷酸腺苷誘導〕。對照組晨起抽取肘靜脈血5 ml 置于109 mmol/L 枸櫞酸鈉抗凝真空管(美國BD公司)，2 h內應用流式細胞儀(美國Becton Dickin 公司)檢測血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表達率。

1.2.3 ADP抑制率的檢測 用含109 mmol/L的枸櫞酸鈉0.4 ml抗凝的真空采血管和肝素鈉真空采血管分別采血2.7 m1和3.0 ml，3 h內應用TEG@5000(美國Haemoscope公司產)檢測ADP抑制率。試劑包括：花生四烯酸(AA)、ADP、激活劑F(由蝮蛇血凝酶和血小板XⅢa因子混合而成)、高嶺土(含1%kaolin液)。

1.2.4 出血分級標準 依據血流分級(TIMI)出血評分標準[2]進行分級，主要出血：顱內出血或臨床可見的出血(包括影像學)，伴Hb水平下降>50 g/L；小出血：臨床可見的出血(包括影像學)，伴Hb水平下降30～50 g/L；輕微出血：臨床可見的出血(包括影像學)，伴Hb水平下降<30 g/L。

1.3 觀察指標 流式細胞術檢測血小板活化標志物PAC-1 和CD62p受體表達量，TEG檢測反映氯吡格雷效果的ADP抑制率，同時隨訪患者1年內缺血事件和出血事件發生率。

2 結果

2.1 觀察組患者臨床資料 觀察組患者臨床資料詳見表1。

表1 患者臨床資料(n=89)Table 1 The clinical data of patients

注：WBC=白細胞計數，Hb=血紅蛋白，GLU=血糖，K=鉀離子，Na=鈉離子，Cl=氯離子，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，UA=血尿酸，BNP=腦利鈉肽，PT=凝血酶原時間，APTT=活化部分凝血活酶時間，Fgb=纖維蛋白原,PLT=血小板計數

2.2 氯吡格雷反應性判斷標準 根據統計學四分位數間距法,計算出血小板活化標記物表達量,定義血小板活化標記物CD62p>15.5%同時PAC-1>3.01%為血小板活化程度高表達，代表氯吡格雷反應性較低；血小板活化標記物CD62p>15.5%或者PAC-1>3.01%為血小板活化程度中等表達；血小板活化標記物CD62p<15.5%或者PAC-1<3.01%為血小板活化程度低表達，代表氯吡格雷反應性較好。

2.3 ADP抑制率與CD62p、PAC-1表達率擬合度 以流式細胞術檢測的CD62p、PAC-1反應血小板功能，參考國外Godino等[3]研究中采用統計學四分位數間距法定義，兩者表達率均明顯增高(以CD62p>15.5%和PAC-1>3.01%定義為氯吡格雷反應性低即血小板高反應性)，評估TEG檢測方法，當ADP抑制率為38.9%時靈敏度為97.0%、特異度為61.1%，ROC曲線下的面積為0.932(P=0.001，見圖1)。

圖1 ADP抑制率診斷氯吡格雷低反應性的ROC曲線Figure 1 ROC curve of ADP inhibition rate for diagnosis of clopidogrel low reactivity

2.4 PAC-1表達率與ADP抑制率的比較 血小板活化程度高表達患者有46例，中等表達患者43例，無低表達患者(見圖2)。結合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應性較低。

圖2 PAC-1表達率與ADP抑制率的比較Figure 2 Comparison of the expression inhibition rate of PAC-1 and ADP

2.5 CD62p表達率與ADP抑制率的比較 血小板活化標記物CD62p>15.5%同時PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表達患者46例，中等表達患者43例，無低表達患者(見圖3)。結合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應性較低。

2.6 患者隨訪結果 反應性較低的患者與反應性中等的患者缺血事件發生率和出血事件發生率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。所有隨訪患者僅4例發生輕微出血，主要表現為局部皮下出血、牙齦出血和眼底出血。

圖3 CD62p表達率與ADP抑制率的比較Figure 3 Comparison of the expression inhibition rate of CD62p and ADP

3 討論

阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療是目前接受PCI和/或急性冠脈綜合征患者的標準治療[4]。然而，盡管在PCI后服用阿司匹林和氯吡格雷，1.0%～1.9%患者仍可能會發生急性或亞急性支架內血栓形成[5]。有研究認為，氯吡格雷的低反應患者發生心血管事件的風險增加了20%[6-7]。此外，有數據表明，支架置入后1個月內的氯吡格雷低反應性可以預測不良心血管事件[8]。冠心病患者行PCI后需長期服用抗血小板藥物，但服用雙聯抗血小板藥物仍然有患者發生心腦血管再次缺血[9]，還有患者在服用藥物期間因各種原因發生出血并發癥。因此，在臨床環境中探索患者對服用抗血小板藥物的反應是目前全世界心血管臨床醫生共同面臨的難題[10]。

本研究通過檢測行PCI患者術后1周服用雙聯抗血小板藥物血小板活化標記物的表達率及血小板ADP抑制率，以探索TEG檢測氯吡格雷的反應性，并尋找能在臨床應用中相對準確地反映患者血小板功能狀態的實驗室檢查方法及判定范圍。

本研究連續觀察了89例同意參加本試驗并行PCI的冠心病患者89例，年齡67～79歲，為高齡患者；其中糖尿病患者39例(43.8%)，血管病變為三支或左主干+三支病變53例(59.6%)，行3枚及以上支架24例(26.9%)。本研究發現，按照血小板活化標記物CD62p、PAC-1用統計學四分位數間距法界定的氯吡格雷反應性較低患者有40例(44.9%)，與目前文獻報道的氯吡格雷低反應性發生率波動在5%～44%相近[11]，可能與本研究連續入選的為高齡患者，且復雜病變、多支病變發生率>50%，糖尿病患者的比例較高有關[12]。經過1年的臨床隨訪觀察，氯吡格雷反應性較低的40例患者中有1例行PCI后1年內行冠狀動脈旁路移植術，同時有1例患者死亡,3例因嚴重心臟缺血致心律失常、心絞痛等再入院；與氯吡格雷反應中等的49例患者相比，前者在缺血事件上相對增多,但兩組缺血事件發生率無明顯差異，可能與本研究樣本數量較少有關。此外，氯吡格雷反應性較低患者較氯吡格雷反應性中等患者的輕微出血率低，但兩組無明顯差異。以上結果提示，對高齡、高危冠心病患者進行TEG監測有一定臨床意義，但因本研究樣本量較少，結果可能存在偏倚，提示今后可繼續擴大樣本量進行深入研究。

本研究通過TEG檢測患者ADP抑制率[13]，反映患者對氯吡格雷的反應性。結果顯示，當ADP抑制率為38.9%時，靈敏度為97.0%、特異度為61.1%、ROC曲線下面積為0.932。臨床檢驗科提示TEG檢測的ADP抑制率>50%為藥物反應良好,如果<20%說明血小板對藥物反應性差，因此本研究以ADP抑制率<38.9%可以較準確地反映患者對氯吡格雷的反應性較低，若按照<20%界定就可能漏掉一些高危患者，所以繼續擴大樣本延長隨訪時間有助于更準確地反映患者對抗血小板藥物的反應性。本研究通過流式細胞術檢測血小板活化標記物CD62p、PAC-1表達率與TEG檢測ADP抑制率的比較顯示，血小板活化標記物CD62p>15.5%同時PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表達患者46例，中等表達患者43例，無低表達患者。結合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反應性較低。因此，與較昂貴且繁瑣的流式細胞術相比，臨床應用TEG檢測可以監測對氯吡格雷反應性較低的患者，進而降低心腦血管事件(死亡、非致命性心肌梗死、再次血運重建、腦卒中)發生率。

表2 患者1年缺血事件和出血事件的隨訪結果〔n(%)〕Table 2 Follow up of the patients with 1 years of ischemic events and bleeding events

注：-表示無此數據

PCI后再狹窄是困擾醫師與患者的主要問題，強化抗血小板治療并不能對每位患者起到良好效果。日本、韓國的幾項臨床研究提示，氯吡格雷無反應性或反應性低下的發生率為4%～40%[14-15]。目前臨床研究提示，加大首次負荷劑量甚至給予兩次負荷劑量可以提高氯吡格雷的抗血小板作用[16]。也有研究認為，合用替羅非班可以降低選擇性PCI后的心肌梗死發生率[17]。對氯吡格雷反應性差異的研究仍在探索中，全世界心血管醫生正努力尋找解決方案。有研究提示，新型抗血小板藥物替格瑞洛可能是解決對氯吡格雷反應性低下患者的另一類機制藥物，但仍需要臨床研究證實。

綜上所述，TEG檢測冠心病患者行PCI后對氯吡格雷低反應性的ADP抑制率<38.9%，提示患者對藥物可能存在抵抗，在臨床工作中需關注這部分患者，以降低患者心腦血管事件的發生率。

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