MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病易患性關聯的Meta分析

高顯會，張國毅，王 瑩，張慧影

血液透析是一種安全有效的血液凈化方法，常用于終末期腎臟病(ESRD)的治療[1]。慢性腎衰竭患者通過血液透析可除去體內多種代謝產物及多余水分，降低高血鉀等，從而達到治療疾病的目的。近年來，血液透析技術有了明顯進步，慢性腎衰竭患者的存活率雖有所改善但仍較低，主要是由于心血管疾病的發生率增加所致。有研究表明，慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的發病率是正常人群的10～20倍，已成為長期血液透析患者的主要并發癥和致死原因[2]。最新研究顯示，在慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的發生發展過程中，非傳統危險因素如血紅蛋白水平、炎癥和氧化應激反應以及遺傳多態性可能發揮了重要作用[3]。

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝的關鍵酶，位于1號染色體1p36.3位置，全長17 kb，包含11個外顯子[4]。人類MTHFR基因存在29種不同位點的基因突變，其中677C>T位點突變最為常見。當MTHFR基因突變時可明顯降低MTHFR的活性，使蛋氨酸循環發生障礙，血漿高同型半胱氨酸(Hcy)水平升高。已有研究顯示，Hcy水平升高已被確認為腦血管、周圍血管疾病和冠心病的獨立危險因素[5]，故MTHFR基因突變被認為是慢性腎衰竭患者發生心血管疾病的重要危險因素。本研究通過全面收集相關研究，評價MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病易患性的關聯，以期為慢性腎衰竭血液透析患者早期預防心血管疾病的發生提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 文獻納入與排除標準 文獻納入標準：(1)關于MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病發病風險關聯的臨床研究；(2)患者(病例組)均有典型慢性腎衰竭的臨床診斷[6]，均接受慢性腎衰竭透析，不包括慢性腎衰竭未透析或行腹膜透析者；(3)心血管疾病定義為有冠心病、心肌梗死、腦卒中、短暫性缺血性腦卒中的發病史，通常借助影像學的診斷技術(動態血壓監測、超聲心動圖、CT冠狀動脈成像等)監測其血脂、血壓或心室心功能狀態異常，并結合其臨床特征判斷；(4)納入文獻均提供完整的MTHFR基因677C>T單核苷酸多態性的頻率數據；(5)對照組的MTHFR基因677C>T單核苷酸多態性頻率均符合哈迪-溫伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。納入文獻的語言為中文或英文。不符合上述納入標準的文獻被排除。同一作者采用相同病例進行多項研究并發表時僅納入樣本量最大的研究或最近發表的文獻。

1.2 文獻檢索 依據制定的檢索策略進行檢索，計算機檢索Web of Science(1945—2013年)、Medline(1966—2013年)、EMBase(1980—2013年)、CINAHL(1982—2013年)、萬方數據庫(1998—2013年)和中國知網(1915—2013年)。采用主題詞和自由詞相結合的文獻檢索策略，中文檢索詞主要包括：慢性腎功能衰竭，血液透析，心血管疾病，亞甲基四氫葉酸還原酶基因，MTHFR，單核苷酸多態性等；英文檢索詞包括：chronic renal failure，Hemodialysis，cardiovascular disease，methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR，genetic polymorphism等。手工檢索納入文獻的參考文獻以發現潛在符合納入標準的研究。

1.3 數據提取 依據統一制定的數據收集表，由高顯會和張國毅兩位研究者分別獨立提取數據。數據收集表項目主要包括：第一作者、發表時間、國家、種族、語言、樣本量、樣本來源、等位基因頻率、SNP檢測方法、HWE平衡等，如存在爭議，則通過與第三方討論解決分歧。

1.4 納入文獻質量評分 由王瑩和張慧影兩位研究者根據Newcastle-Ottawa Scale(NOS)評分量表[7]分別對納入文獻的質量進行評價。NOS評分量表滿分為9分，包括病例組和對照組研究對象的定義和選擇(0～4分)、兩組的可比性(0～2分)、暴露因素的確定(0～3分)。得分≤3分為低質量文獻，4～6分為中等質量文獻，≥7分為高質量文獻。

1.5 統計學方法 采用Stata 12.0軟件行Meta分析。采用固定效應模型或隨機效應模型計算優勢比(OR)及其95%可信區間(95%CI)評價MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病發生風險的關聯性，并對合并效應值進行Z檢驗。各文獻間異質性采用Cochran Q檢驗進行分析，若P<0.10則提示存在統計學異質性[8]；采用I2檢驗定量評價異質性大小，I2介于0～100%，I2愈大提示異質性愈明顯；如異質性檢驗P<0.10或I2>50%則提示各研究間存在異質性，故采用隨機效應模型(DerSimonian Laird法)分析，反之則采用固定效應模型(Mantel-Haenszel法)分析[9]。根據不同種族進一步行亞組和Meta回歸分析以探究各文獻間異質性來源，并逐一刪除納入文獻進行敏感性分析以評價單一文獻對總體結果的影響。

2 結果

2.1 納入文獻基線特征 最初檢索到相關文獻156篇，根據其題目和摘要剔除78篇，進一步閱讀全文并分析數據完整性剔除不符合納入標準的文獻70篇，最終共8篇前瞻性隊列研究文獻符合納入標準進入Meta分析[10-17]，共包括2 292例慢性腎衰竭血液透析患者。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖Figure 1 Flow chart of literature search and study selection

納入文獻的發表時間為2000—2011年。納入文獻中4篇文獻[10,13,15,17]的研究對象為亞洲人群，3篇文獻[12，14，16]的研究對象為歐洲人群，1篇文獻[11]的研究對象為非洲人群。納入文獻均采用外周血標本進行多態性檢測，其中5篇文獻[10，12，14-15，17]采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RELP)檢測，3篇文獻[11，13，16]采用直接測序法(direct sequencing)。納入文獻的基因型分布均符合遺傳學HWE平衡(P>0.05)。納入文獻的質量為中等偏上(NOS評分>6分)。納入文獻的基線特征和質量評分見表1。

2.2 Meta分析結果 納入文獻間異質性明顯(P<0.05)，采用隨機效應模型進行Meta分析，MTHFR基因677C>T多態性能增加慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性〔TT與CC：OR=2.75，95%CI(1.35，5.59)，P=0.005；CT+TT與CC：OR=1.39，95%CI(1.09，1.78)，P=0.008；TT 與CC+CT：OR=2.52，95%CI(1.25，5.09)，P=0.010，見圖2〕。

亞組分析在TT與CC和CT+TT與CC兩種基因模型下展開。根據不同種族進行亞組分析發現，在亞洲人群中MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性相關〔TT與CC：OR=3.38，95%CI(1.11，10.28)，P=0.032；CT+TT與CC：OR=1.44，95%CI(1.05，1.97)，P=0.022〕，在非洲人群和歐洲人群中并未發現關聯性(P>0.05)。進一步根據基因檢測方法進行亞組分析發現，在PCR-RFLP 檢測方法下MTHFR基因677C>T多態性均會〔TT與CC：OR=4.00，95%CI(1.19，13.53)，P=0.025；CT+TT與CC：OR=1.61，95%CI(1.11，2.32)，P=0.012〕，在直接測序法下TT與CC模型增加慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性〔OR=2.11，95%CI(1.30，3.42)，P=0.003〕，在CT+TT與CC模型下未發現關聯性〔OR=1.16，95%CI(0.83，1.61)，P=0.394，見圖3〕。

2.3 異質性與敏感性分析 采用Meta回歸分析是否存在異質性，結果顯示種族和樣本量可能為異質性的主要來源(見表2)。本研究逐一刪除納入文獻進行敏感性分析以評價單一文獻對總體結果的影響，結果表明無單一文獻可顯著影響原始分析和亞組分析統計學結果。

表2 單因素和多因素Meta回歸分析結果Table 2 Univariate and multivariate Meta-regression analyses of potential source of heterogeneity

3 討論

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心血管疾病的獨立危險因素[18]。Hcy又稱高半胱氨酸，其代謝相關酶的基因多態性可引起血漿中Hcy水平的改變[19]。MTHFR是催化Hcy向甲硫氨酸轉化的關鍵酶，MTHFR基因第677位突變導致丙氨酸被纈氨酸代替，使該酶活性缺陷或下降，嚴重阻礙了Hcy向蛋氨酸的轉化，從而影響血漿中Hcy水平，最終導致高HHcy。臨床資料顯示，伴有輕度或中度HHcy的慢性腎衰竭血液透析患者是發生心血管疾病的高危人群。故推測，MTHFR基因突變可能與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的發病風險密切相關[20]。

本研究結果顯示，MTHFR基因 677C>T多態性會增加慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病易患性，提示該基因多態性可能是引發慢性腎衰竭血液透析患者發生心血管疾病的一個重要危險因素；其機制可能是由于MTHFR基因677C>T多態性會導致MTHFR酶活性降低，影響Hcy代謝中的再甲基化途徑，引起血漿Hcy總水平升高，從而導致心血管疾病的發病率升高。Haviv等[14]認為MTHFR基因多態性和低血清葉酸水平在血漿Hcy水平中起著重要作用，而血漿Hcy水平可作為檢測慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的重要因素，故MTHFR基因多態性亦能間接反應患者的心血管狀況。本研究根據種族、測量方法和樣本量進行了亞組分析，結果顯示在亞洲人群中基因MTHFR 677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性增加顯著相關，而在歐美人群和非洲人群中并未發現類似關聯性。該結論與陳倩茹等[21]的結果類似，認為MTHFR基因多態性存在明顯的地域差異，在歐美地區發生率呈南高北低分布格局，而在中國呈南低北高的分布趨勢，這可能與基因漂移、物種自然選擇、突變位點差異等因素有關。進一步根據樣本量進行分層分析，結果顯示在大樣本亞組中MEHFR基因 677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病易患性有關聯，而在小樣本亞組中并未發現統計學關聯，該結果出現的原因可能與小樣本研究數據統計效能有限有關；進一步的Meta回歸分析也證實，種族與樣本量可能是異質性的主要來源。

表1 納入文獻基線特征與質量評分Table 1 Baseline characteristics and methodological quality of included studies

注：-代表原文數據缺失；PCR-RFLP=聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法，HWE=哈迪-溫伯格平衡定律

圖2 MTHFR基因66TC>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者并發心血管疾病易患性關聯的森林圖Figure 2 Forest plots for the relationships between MTHFR 677C>T polymorphism and the risk of cardiovascular disease in chronic Hemodialysis patients

圖3 MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者并發心血管疾病易患性關聯亞組分析的森林圖Figure 3 Forest plots for subgroup analysis of the relationships between MTHFR 677C>T polymorphism and cardiovascular disease in chronic hemodialysis patients

本研究存在一定的局限性：(1)納入文獻過少可能影響Meta分析結果的統計效能，今后可擴大樣本量進一步研究；(2)本研究各納入文獻的基因檢測方法不同，可能是本研究異質性來源之一，易導致假陰性或假陽性的結果；(3)由于無法獲取納入文獻的原始數據，限制了本研究針對MTHFR基因677C>T多態性與慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性進行深入探討。盡管納入文獻時均有明確的標準，但仍可能存在一些未考慮到的潛在因素影響結果。因此，今后仍需進一步擴大樣本量進行研究。

基于目前的研究，本研究可初步得出以下結論：MTHFR 基因677C>T多態性可能會增加亞洲人群慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病的易患性。因此，MTHFR 基因677C>T多態性的檢測對早期診斷慢性腎衰竭血液透析患者心血管疾病發生有重要意義。鑒于本研究存在的上述局限性，本結論尚需大樣本高質量的遺傳學研究加以證實。

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