結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細胞的變化

王建升 張立志 帖彥清 呂元鵬 宋津曉

結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細胞的變化

王建升 張立志 帖彥清 呂元鵬 宋津曉

目的 檢測結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中輔助性T細胞（Th）17與殺傷性T細胞（Tc）17細胞比例的變化，并分析兩者的相關性。方法收集結直腸息肉17例、結直腸腺瘤34例和結直腸癌42例患者資料，另取17名健康志愿者為對照。流式細胞術檢測患者和健康對照外周血中Th17和Tc17細胞比例；ELISA法檢測血清中白細胞介素（IL）-17A和IL-23水平。結果結直腸腺癌組患者外周血中Th17和Tc17細胞比例以及IL-17A和IL-23水平最高，結直腸腺瘤及息肉組較高，對照組兩種細胞比例及兩因子水平最低，結直腸腺瘤組Tc17細胞比例高于結直腸息肉組，但兩組Th17細胞比例、IL-17A和IL-23水平差異無統計學意義。相關性分析表明Th17和Tc17細胞呈正相關（rs=0.594）。結論在結直腸息肉或結直腸腺瘤向結直腸癌發展中，外周血Th17和Tc17細胞比例均明顯增多，且兩者呈正相關。

細胞因子類；結直腸息肉；結直腸腺瘤；結直腸癌；Th17細胞；Tc17細胞

結直腸癌是消化系統最常見的一類腫瘤，其病因復雜，目前仍不清楚。有證據表明，在結直腸癌的發生發展過程中大多會涉及機體的免疫細胞和免疫因子的異常[1-2]。輔助性T細胞（Th）17/殺傷性T細胞（Tc）17是一類由初始CD4+T/CD8+T細胞分化而來的效應T細胞，它們參與了腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的發生和發展[3-4]。目前，關于Th17和Tc17細胞及其相關細胞因子白細胞介素（IL）-17A、IL-23在結直腸癌發展過程中的變化情況，國內尚鮮見報道。本研究檢測結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細胞比例變化，并檢測患者血清中IL-17A和IL-23水平的變化，旨在進一步探討結直腸癌發生發展中的免疫病理機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2010年6月—2012年12月結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸腺癌患者。所有患者的血標本收集前均未行放射治療、化學治療、生物治療及中西醫結合治療。排除有癌家族史、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎性腸病及家族性息肉者。所有患者均經病理診斷證實且確定其病理類型。其中結直腸息肉組17例（結腸息肉9例，直腸息肉8例），男7例、女10例，平均年齡（62.2±8.4）歲；結直腸腺瘤組34例（結腸腺瘤20例，直腸腺瘤14例），男21例、女13例，平均年齡（65.2±9.1）歲；結直腸腺癌組42例（結腸腺癌18例，直腸腺癌24例），男20例、女22例，平均年齡（64.5±11.9）歲。選擇同期在我院進行體檢的健康人群17例為健康對照組，男10例、女7例，平均年齡（63.6±9.4）歲。各組年齡（F=0.353）、性別（χ2=2.717）差異無統計學意義（P＞0.05）。所有受試者均簽署知情同意書，并報倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 Ficoll-Hypaque分離液購自Sigma公司；佛波酯、離子霉素、布雷菲得菌素A、FIX&PERM Kit Reagent、鼠抗人CD3、CD8、IL-17A及其相應的同型對照、IL-17A、IL-23酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自eBioscience公司。

1.3 標本收集 所有受試對象于清晨抽取空腹外周血,其中4 mL置入肝素鈉抗凝管內，Ficoll-Hypaque液分離外周血單個核細胞（PBMCs）用于流式細胞學檢測；5 mL外周血離心后取血清儲存于-80℃以備分析IL-17A和IL-23用。

1.4 Th17和Tc17細胞流式檢測 分離的PBMCs以1×106/mL鋪于48孔培養板各孔中，每孔加入1 mg/L離子霉素和25 mg/L佛波酯各20 μL，然后加入10 mg/L布雷菲得菌素A 20 μL，于5%CO2孵箱37℃孵育5 h。用FITC標記的鼠抗人CD8單抗和PE-Cy5標記的鼠抗人CD3單抗進行細胞表面分子染色，通過Reagent A固定、Reagent B破膜后再用PE標記的抗人IL-17A單抗標記胞內抗體，0.5 mL 1%多聚甲醛PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，采用CellQuest分析軟件對結果進行分析。Th17細胞以CD3+、CD8-、IL-17+T細胞在CD4+T細胞中的百分比表示；Tc17細胞以CD3+、CD8+、IL-17+T細胞在CD3+T細胞中的百分比表示。

1.5 ELISA檢測IL-17A和IL-23水平 收集所有受試對象的血清,用雙抗體夾心法進行人IL-17A和IL-23的檢測。操作過程均按ELISA試劑盒說明書進行。

1.6 統計學方法 所有數據采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；非正態數據用M(P25,P75)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，2組間比較采用Mann-Whitney檢驗。相關分析采用Spearman相關分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血中Th17和Tc17細胞比例變化 4組Th17細胞和Tc17細胞比例差異有統計學意義（P＜0.01），其中結直腸腺癌組兩種細胞比例最高，健康對照組兩種細胞比例最低，結直腸腺瘤組Tc17細胞比例高于結直腸息肉組（P＜0.05），但2組Th17細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組外周血中IL-17A和IL-23水平變化 各組IL-17A和IL-23水平差異有統計學意義，其中結直腸腺癌組兩種因子水平均最高，健康對照組水平最低（P＜0.05），而結直腸息肉組和結直腸腺瘤組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Table 2 Comparison of the serum levels of IL-17A and IL-23 in healthy control groups and patient groups表2 各組血清中IL-17A和IL-23水平結果比較（μg/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，P＜0.05

組別健康對照組（1）結直腸息肉組（2）結直腸腺瘤組（3）結直腸腺癌組（4）F n 17 17 34 42 IL-17A 4.65±2.59 7.19±3.67a7.50±3.81a12.89±11.94abc5.781＊＊IL-23 16.87±8.83 38.67±27.86a38.06±27.41a58.05±35.00abc8.862＊＊

2.3 各組外周血中Th17細胞、Tc17細胞、IL-17A和IL-23相關性分析 Th17和Tc17細胞呈正相關（rs=0.594）。Th17細胞與IL-17A（rs=0.829）和IL-23（rs=0.442）呈正相關。Tc17細胞與IL-17A（rs=0.337）和IL-23（rs=0.585）呈正相關（均P＜0.01）。

3 討論

3.1 Th17細胞在腫瘤中的變化 Th17細胞是近年來發現的一類新型細胞亞群，介導炎性反應，在慢性炎癥、自身免疫性疾病和移植排斥反應的發生和發展中發揮重要的作用[5-6]，但對Th17細胞在腫瘤免疫中的作用及意義目前尚不完全清楚。越來越多的證據表明,荷瘤小鼠和多種腫瘤患者的外周血、瘤組織、骨髓、脾等檢測到了高水平的Th17細胞[7]。進一步分析表明，Th17細胞高水平并非腫瘤特異性的，在人卵巢癌晚期、胰腺癌及腎癌中也發現了Th17細胞的高表達，且相應腫瘤組織中的Th17細胞隨著腫瘤的發展也逐漸增多[7]，表明Th17細胞高表達是腫瘤患者的一個普遍特征。但Th17細胞及其特征細胞因子IL-17A究竟是起促進、還是抑制腫瘤的作用，目前仍存在爭議[8]。

3.2 Th17細胞及其相關細胞因子在結直腸癌發生發展中的作用 動物實驗證實，Th17細胞及其相關細胞因子IL-17A和IL-23介導的炎性反應能誘導腸腺瘤和結腸癌的發生[8]。鼠腺瘤模型的瘤組織中存在異常增多的不能分泌IL-10的調節性T（Treg）細胞，這種異常的Treg細胞不能有效地控制Th17細胞介導的炎性反應，從而導致腺瘤的發展[9]。在產生腸毒素的脆弱類桿菌（ETBF）引發的腸炎和結腸癌鼠模型中，ETBF能引發較強的Th17細胞炎性反應，這種炎性反應最終導致腸炎和結腸腫瘤的形成，但Tc17細胞在此過程中的作用不明顯[10]。IL-17A在“腺瘤→腺癌”順序中的腺瘤期就表達異常，其高表達與腸上皮不典型增生程度密切相關[11]。本研究表明，結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中Th17細胞比例均高于健康對照，從結直腸息肉或結直腸腺瘤到結直腸癌發展中，其數量明顯增多，其相關細胞因子IL-17A和IL-23也呈現類似的變化趨勢。相關性分析表明，Th17細胞與IL-17A、IL-23呈正相關，提示Th17細胞及其相關因子IL-17A和IL-23可能參與了人結直腸癌發生發展的免疫病理過程。

3.3 Tc17細胞在腫瘤中的表達 Tc17細胞是近年來發現的又一類新型細胞亞群，其在感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究頗多，但在腫瘤尤其是結直腸癌中的報道較少。胃癌患者外周血和腫瘤組織中的Tc17細胞隨著疾病的進展而增加，且腫瘤組織中的Tc17細胞比例明顯高于外周血，高比例的Tc17細胞與胃癌患者的總生存期和無病生存期呈負相關，并可作為一個獨立的預測預后的指標[12]。與健康人外周血相比，鼻咽癌患者外周血中有低比例Tc17細胞，而瘤組織則存在高比例Tc17細胞，這是因為Tc17細胞能高表達趨化因子受體6（CCR6），而腫瘤組織高表達CC型趨化因子配體20（CCL20），后者能募集Tc17細胞到腫瘤微環境中，致使患者外周血中的Tc17細胞數量減少[13]。本研究表明，結直腸息肉、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血中Tc17細胞比例都高于健康對照，從結直腸息肉到結直腸腺瘤再到結直腸癌，其數量逐漸增多。相關性分析表明，Tc17細胞不僅與IL-17A和IL-23呈正相關，而且與Th17細胞呈正相關。但結直腸腺瘤組Tc17細胞比例高于結直腸息肉組，而兩組Th17細胞比例無明顯差異，提示Tc17細胞和Th17細胞的分化調控可能存在一些差異。

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（2013-07-18收稿 2013-12-06修回）

（本文編輯 李鵬）

The Changes of Circulating Th17 and Tc17 Cells in Patients with Colorectal Polyp, Adenoma and Cancer

WANG Jiansheng,ZHANG Lizhi,TIE Yanqing,LYU Yuanpeng,SONG Jinxiao
Clinical Laboratory，Hebei General Hospital,Hebei 050051,China

Objective To compare ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in patients with colorectal polyp(CRP), colorectal adenoma(CRA)and colorectal cancer(CRC)，and analyse their relationship.MethodsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in 93 patients（17 CRP,34 CRA and 42 CRC）and 17 healthy donors were examined by flow cytometry; Serum levels of IL-17A and IL-23 were tested by ELISA.ResultsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells and the serum levels of IL-17A and IL-23 were the lowest in healthy control groups,medium in CRP and CRA groups and the highest in CRC groups(P＜0.05).The proportions of Tc17 cells in CRA groups were significantly higher compared to those in CRP groups，but no statistical significance of proportion of circulating Th17 cells as well as serum levels of IL-17A and IL-23 between CRA and CRP groups was observed(P＞0.05).Further analysis showed that there was a positive correlation between proportions of circulating Th17 and Tc17 cells(rs=0.594,P＜0.001).ConclusionThe proportions of circulating Th17 and Tc17 cells were positively related and the ratio of Th17 over Tc17 was markedly increased from CRP group or CRA group to CRC group.

cytokines；colorectal polyp；colorectal adenoma；colorectal cancer；Th17 cells；Tc17 cells

R735.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.007

河北省人民醫院檢驗科（郵編050051）