改良豬腦死亡模型的建立*

萬晨光 馮學泉 李 牧△ 杜洪印 張瑋曄 史 源 劉 蕾 沈中陽

實驗研究

改良豬腦死亡模型的建立*

萬晨光1馮學泉1李 牧1△杜洪印2張瑋曄3史 源3劉 蕾3沈中陽3

目的 建立一種穩定、可靠的豬腦死亡模型，為研究腦死亡模型建立過程中、腦死亡判定后的腦組織病理改變及器官移植免疫等變化提供一個更加穩定的動物模型。方法以經典的硬膜外顱內加壓法為基礎，在長白豬顱內置入Codman有創顱內壓監測探頭，在實時監測顱內壓變化情況下，根據顱內壓與平均動脈壓（MAP）的關系進行間斷顱內加壓建立腦死亡模型。結果12例實驗用長白豬，1頭死于麻醉意外，余11頭均成功誘導腦死亡模型。經有效呼吸循環支持可維持腦死亡模型（31.3±4.7）h。通過經顱多普勒、腦電圖、心電、MAP等監測顯示，腦死亡模型制作過程中各參數變化平穩，腦死亡判定后，動物模型可長時間維持。結論在顱內壓監測條件下建立豬腦死亡動脈模型的方法穩定可靠，易于標準化，可為腦死亡模型建立過程中及腦死亡判定后的腦功能及器官移植免疫等研究提供更加穩定的載體。

腦死亡；顱內壓；模型，動物；豬；硬膜外顱內加壓

腦死亡（brain death，BD）是由哈佛大學醫學院于1968年提出的現代死亡概念,指全腦功能不可逆性的喪失。腦死亡概念提出后，腦死亡患者成為器官移植的主要供體來源，但患者外周器官多有缺血、炎癥反應[1]，使器官移植術后的治療更加復雜。本研究以經典的“硬膜外顱內加壓法”[2]豬腦死亡模型為基礎，應用有創腦組織實時顱內壓（intracranial pressure,ICP）監測手段，根據ICP與平均動脈壓（MAP）關系進行緩慢間斷水囊加壓，建立了一種改良的腦死亡動物模型，為研究腦死亡模型建立過程中、腦死亡判定后的腦組織病理改變及器官移植免疫變化等研究提供一個更加穩定的載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康、清潔級長白豬12頭，體質量（33.6±4.7）kg，雌雄不限，購自天津市實驗動物飼養中心，術前禁食12 h，禁水6 h。Codman顱內壓監護儀1臺，Codman腦組織型ICP監測探頭1個，RIMED公司經顱多普勒（transcranial doppler,TCD）儀器1臺、美國BIOPAC公司MP150 16通道生理信號記錄分析系統1套、harvard動物手術臺1個、Matrx model3000麻醉機及Beneview T8麻醉監護儀各1臺。

1.2 方法 （1）麻醉。臀部注射10 mg地西泮鎮靜，肌內注射阿托品1 mL（0.02～0.05 mg/kg）抑制呼吸道分泌物，10 min后給予基礎麻醉：肌內注射氯胺酮300 mg（10～30 mg/kg）。仰臥位固定豬，尾部脫毛放置氧飽和度探頭。氣管插管后，予以維庫溴銨維持全身麻醉，膀胱造瘺置入尿管并固定，外接尿袋。（2）動、靜脈置管。頸部手術暴露頸外動脈、頸內靜脈，直視下單側頸外動脈切開，向近心端插入導管并固定，外接三通，連接監護儀監測心電圖（ECG）、血壓（BP）；雙側頸內靜脈球部插管，肝素封管以備行血氣分析，股靜脈插管以液體支持。（3）放置Foley水囊及顱內壓監測探頭。氣管及血管插管后改變實驗豬體位，使其俯臥位，頂部去毛，切開頭皮，雙眼連線與正中矢狀線交點后1 cm處行顱骨鉆孔術，暴露硬腦膜，鈍性分離骨窗周圍硬腦膜與顱骨，置入14號Foley水囊導管后用骨蠟封閉鉆孔處，縫合頭皮。鉆孔處后1 cm，右側旁開2 cm處電鉆錐顱，置入Codman腦組織型ICP監測探頭并固定，探頭距頭皮2.5 cm，外接ICP監護儀。（4）置入針狀電極。電鉆錐顱，第一對電極針（FP1、FP2）置于基線（雙眼眶內側連線）前2 cm，矢狀線左右各1 cm；另一對電極針（F7、F8）置于基線后1 cm，矢狀線左右各3 cm；第三、四對電極針置于基線后2.5、4 cm，矢狀線左右4 cm，連接MP150 16通道生理信號記錄分析系統行腦電圖（EEG）監測。（5）顱內加壓。腦死亡誘導前觀察豬ICP、MAP、心率（HR），穩定10 min后，緩慢間斷以0.5 mL/min速度向顱內氣囊導管內注射生理鹽水加壓，當ICP＞MAP時停止加壓，待MAP上升大于ICP時繼續加壓，直至MAP不隨ICP上升為止。

1.3 腦死亡判定時間及標準 顱內加壓停止1 h后停止麻醉支持，繼續予以呼吸機輔助呼吸，待麻醉停止1 h后對實驗豬進行腦死亡判定。參考我國于2009年頒布的《腦死亡判定標準（成人）》[3]，擬定腦死亡判定標準如下：（1）瞳孔對光反射消失。（2）角膜反射消失。（3）刺激豬頭面部，實驗豬無反應。（4）無自主呼吸。（5）TCD顯示前循環、后循環顯示振蕩波、尖小收縮波或血流信號消失。（6）腦電圖顯示電靜息。（7）阿托品試驗陰性。首次判定12 h后再次復查，結果仍符合腦死亡判定標準者，方可最終確認為腦死亡。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 模型成功率及維持時間 12頭實驗長白豬中1頭死于麻醉意外，余11頭均成功誘導腦死亡模型，經有效呼吸循環支持可維持腦死亡模型（31.3±4.7）h。

2.2 ICP及MAP情況 在顱內加壓前，ICP為（16.2±3.8）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），MAP為（82.3±11.3）mmHg。顱內加壓初期，ICP上升緩慢，MAP波動不明顯，隨著繼續加壓，ICP劇烈升高，MAP隨之急劇升高，停止加壓后ICP可達（109.4±9.8）mmHg，MAP可升至（107.4±5.9）mmHg。ICP和MAP在較高水平相持一段時間后，MAP先于ICP開始緩慢下降，后MAP穩定于（62.3±12.1）mmHg，ICP穩定于（51.2±9.7）mmHg。

2.3 心率、心電變化 顱內加壓前心率波動于（103.3±12.1）次/min，律齊，各波形正常。顱內加壓初期，心率稍有下降，后隨ICP增高而增快，高達（204.4±31.2）次/min，S-T段壓低。診斷為腦死亡后心率波動于（127.2±14.4）次/min，各波均存在，S-T段壓低，未見明顯心律失常；在實驗豬自然死亡前頻繁出現二聯律、三聯律，后出現室顫波形，血壓不能維持，短時間內實驗豬心跳停止。

2.4 TCD的變化 在行顱內加壓前通過顳窗行TCD檢查，大腦中動脈流速（VMCA）為（64.5±5.8）mm/s，開始顱內加壓后，VMCA逐漸下降，當收縮壓＞ICP＞舒張壓時，TCD顯示大腦中動脈（MCA）頻譜出現舒張期逆向血流。MAP及ICP開始下降后，短時間內MCA頻譜變為振蕩波、尖小收縮波。

2.5 腦電圖的變化 顱內加壓初期，EEG顯示廣泛的爆發，即抑制波形，隨著ICP升高，腦電活動減弱，潛伏期延長，波幅降低，MAP及ICP開始下降后腦電圖快速變為靜息電位，無自主和（或）誘發腦電活動。

3 討論

3.1 實驗動物的選擇 目前已有研究描述了用鼠[4]、貓[5]、狗[6]等動物腦死亡模型的建立，本研究以體質量35 kg左右的長白豬為實驗動物，對實驗設備、實驗環境及動物麻醉要求較高，且有以下優點。首先，豬在解剖學、生理學、血液學及疾病發生機制等方面與人極其相似，目前已作為人類疾病動物模型廣泛應用于各項生物醫學研究。其次，可行頸動脈或頸內靜脈置管，行有創動脈壓、中心靜脈壓監測；可行顱骨鉆孔硬膜外置入加壓水囊，并同時行錐顱置入顱內壓監測探頭、腦電監測探針等；可方便行經顱多普勒監測腦血流，更好地模擬臨床情況，這些都是小動物實驗所不能比擬的。

3.2 實驗方法的選擇 腦死亡模型制作包括頸內動脈結扎法、呼吸暫停法[7]、硬膜外加壓法[8]、顱內制造血腫法[9]、斷頭法等。目前應用較多的為經典的硬膜外水囊加壓法，其方法為顱骨中線處鉆孔，于硬膜外置入Foley水囊，向水囊注水加壓，通過升高顱內壓使腦組織缺血缺氧從而進行腦死亡模型的誘導。模型制作的關鍵在于向水囊加壓注水的速度及總量，但報道的速度為0.05～3 mL/min不等[8,10]，總量8～50 mL，差異較大。由于在加壓過程中缺乏ICP監測，且ICP的變化與顱腔容積之間呈指數關系，故單以注水速度為指標進行加壓較盲目，以致建立起的腦死亡模型個體差異大、穩定性差，不能準確地評價腦死亡后機體生理生化的變化。本研究對經典的硬膜外水囊加壓法進行了改良，其核心即在實時ICP監測的條件下緩慢增高顱內壓力，使其達到MAP水平，使腦灌注壓（cerebral perfusion pressure，CPP=ICP-MAP）為零，進而致全腦缺血、缺氧，引起全腦功能不可逆性喪失，誘導腦死亡模型。

3.3 動物模型的生命體征變化及維持時間 本研究表明，在行加壓初期，ICP升高緩慢，隨著繼續加壓，ICP急劇升高，符合體積—壓力曲線變化；初期，MAP變化并不明顯，后隨ICP增高而急劇升高，推測是由于CPP不足以維持顱內血供，機體對ICP增高引起腦組織缺血代償反應，MAP反射性增高。ICP與MAP在較高水平維持短時間后，MAP先于ICP開始下降，此時腦血流量自動調節功能已喪失，實驗豬已瀕臨腦死亡。在實時ICP監測的條件下進行腦死亡模型的誘導，此方法簡便、易行，由于可通過ICP、MAP調整注水加壓的速度，模型制作過程穩定，一方面可防止ICP升高過快或過高對腦組織造成不必要的損傷，另一方面也可防止ICP過度波動造成動物循環、心臟功能的大幅波動。

本研究表明，在實時監測ICP的條件下，緩慢間斷硬膜外水囊加壓方法建立豬腦死亡模型的過程穩定，模型成功率高、易于標準化，可為腦死亡過程中腦功能、器官移植免疫等方面的研究提供了一個更加符合生理的動物模型。

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[7] 陳曼娥,李廷瓊,陳樹生,等.實驗性腦死亡動物模型制作法探討[J].中國神經精神疾病雜志,1983,5(8):295-297.

[8] 朱長舉,張弓,翟文龍,等.緩慢間斷顱內加壓法豬腦死亡模型的建立[J].醫藥論壇雜志,2008,1(28):26-27，29.

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（2013-11-19收稿 2013-12-02修回）

（本文編輯 李鵬）

讀者·作者·編者

《天津醫藥》協作辦刊單位（排名不分先后）

天津市胸科醫院

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天津港口醫院

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天津金耀集團有限公司

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天津醫學高等專科學校

天津市口腔醫院

天津市第四中心醫院

天津醫科大學口腔醫院

Establishment of Modified Brain Death Model in Pig

WAN Chenguang1,FENG Xuequan1,LI Mu1,DU Hongying2,ZHANG Weiye3,SHI Yuan3,LIU Lei3,SHEN Zhongyang3
1 Department of Neurosurgery,2 Department of Anesthesia,3 Department of Transphant,First Central Clinical Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo establish a stable and reliable model of brain death in swine,and to provide a more stable model for investigating pathomorphology in brain tissue and for studying transplantation immunology during brain death.MethodsBase on the classic methodology of increasing epidural intracranial pressure,Codman intracranial pressure monitoring probes were implanted in landrace pigs invasively.According to the relationship between ICP and MAP,brain death models were established by increasing intracranial pressure slowly and intermittently,with real-time monitoring of the intracranial pressure.ResultsAmong twelve experimental landrace pigs,one died from anesthetic accident,while the rest eleven were successfully established as brain death models.With effective respiratory and circulatory support,those brain death models can be maintained for(31.3±4.7)h.Brain death model establishement is a stable and reliable process demonstrated by transcranial Doppler,EEG,ECG,mean arterial blood pressure and other monitoring methods.After brain death is confirmed,animal models can be maintained for a long time.ConclusionOur methodology of inducing brain death model under ICP monitoring is stable and easy to be standardized.It can also provide a more stable model for studying brain tissue pathomorphology and transplantation immunology.

brain death；intracranial pressure；models,animal；swine；epidural intracranial pressure

R339.39

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.009

*國家863計劃（項目編號：2012AA021001）；衛生部2011年度國家臨床重點專科建設資助項目（項目編號：衛辦醫政函[2011]873）

1天津醫科大學一中心臨床學院神經外科（郵編300192），2麻醉科，3移植外科

△通訊作者 E-mail：Limu5333@163.com