miR-122靶向調控心肌樣細胞誘導分化過程中GATA4基因的表達

郭勵京 張 志 劉紫東 付 偉 季 州

miR-122靶向調控心肌樣細胞誘導分化過程中GATA4基因的表達

郭勵京 張 志△劉紫東 付 偉 季 州

目的 實現大鼠骨髓間充質干細胞（bMSCs）向心肌樣細胞的誘導分化，并驗證分化過程中miR-122靶向調控GATA4基因的表達。方法首先，分離培養bMSCs，應用5-氮雜胞苷（5-azacytidine）將其誘導分化為心肌樣細胞。然后，采用靶基因預測軟件miRanda和TargetScan對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關系進行預測并通過雙熒光素酶報告基因系統鑒定。qRT-PCR檢測誘導分化過程中miR-122和GATA4的表達。結果誘導分化后的細胞平行排列，緊密相連，形態規則均一，免疫熒光化學顯示有心肌肌鈣蛋白I（cTnI）表達。生物信息學方法預測發現miR-122和GATA4基因兩者匹配良好，通過雙熒光素酶報告基因系統檢測發現miR-122能結合到GATA4 mRNA的3′UTR并有效抑制其表達。qRT-PCR檢測結果表明，miR-122的表達水平與GATA4表達呈負相關。結論miR-122能調控心肌樣細胞誘導分化過程中GATA4的表達。

間質干細胞；微RNAs；GATA4轉錄因子；3′非翻譯區；計算生物學；大鼠,Sprague-Dawley；miR-122；心肌樣細胞

MicroRNA（miRNA）是一類內源性的小的非編碼RNA（small noncoding RNA），長度約為21～25 nt，可通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區（3′UTR）完全或部分互補，進而降解該目的mRNA或阻止其翻譯成相關蛋白，下調靶基因表達[1]，以此參與個體發育、細胞分化、細胞增殖以及疾病發生過程中的基因表達調控。GATA4是心肌細胞發育過程中最早表達的轉錄因子之一，在胚胎心臟發育的整個過程中均表達，對心肌細胞的分化起重要作用，是調控心臟發育以及心肌細胞增殖、分化和調亡的重要轉錄因子[2-4]。本研究應用5-氮雜胞苷（5-azacytidine）誘導大鼠骨髓間充質干細胞（bMSCs）分化為心肌樣細胞，利用生物信息學對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關系進行預測，并通過雙熒光素酶報告基因系統鑒定，實時定量PCR（qRT-PCR）檢測誘導分化過程中miR-122和GATA4的表達，以闡明miR-122對GATA4基因表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，普通級，3～6周齡，體質量80～120 g，購于中國醫科大學實驗動物部，生產許可證SCXK(遼) 2008-0005。

1.1.2 菌株、質粒和細胞系 E.coli DH5α感受態細胞和pMD 18-T載體購自TaKaRa公司，pmirGLO載體購自Promega公司，NIH3T3細胞系為遼寧醫學院附屬三院心內科保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 LG-DMEM培養基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶購于Hyclone公司，CD34、CD44、CD29和CD166熒光標記抗體購于Biolengent公司，5-azacytidine購自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆心肌肌鈣蛋白I（cTnI）抗體購自Santa Cruz公司，RNAiso Plus、RNAiso for small RNA、Prime-Script?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ、限制性內切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0購于TaKaRa公司，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep質粒DNA小量試劑盒購自Axygen公司，Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，miRNA模擬物由GenePharma公司合成，Dual-Luciferase?報告基因檢測系統和發光檢測儀購自Promega公司，實時定量PCR儀購于Bio-Rad公司。

1.2 bMSCs的分離與培養 取4～6周SD大鼠，脫頸處死，70%乙醇浸泡5 min，取其股骨和脛骨，PBS洗凈，去掉干骺端，用1 mL無菌注射器，吸取1 mL含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM，反復沖出骨髓，吹打均勻后，接種到25 cm2培養瓶內，于37℃、5%CO2培養箱中培養，3 d后，換液棄去未貼壁細胞。每3～4 d換一次液，待細胞達到80%融合后傳代，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化3 min，用含血清的培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞1∶2傳代，記作P1。

1.3 流式細胞儀鑒定bMSCs 收集P3代細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，分裝于6只1.5 mL離心管內，每管1 mL，分別與FITC和PE熒光素標記的CD29、CD34、CD44、CD166抗體孵育1 h后，上流式細胞儀檢測。

1.4 心肌樣細胞的誘導分化及鑒定 （1）誘導分化。取P3細胞接種于培養瓶和鋪有血蓋片的6孔板內做誘導分化，培養基中加入10 μmol/L 5-azacytidine培養24 h后，PBS沖洗2次，更換完全培養基培養3周，倒置顯微鏡下觀察誘導后細胞的形態。（2）免疫熒光檢測cTnI的表達。取細胞爬片PBS沖洗后，在冷空氣中迅速干燥，用4%甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，0.1%BSA封閉1 h，加兔抗大鼠多克隆cTnI抗體，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，二抗加FITC標記山羊抗兔IgG抗體，抗體濃度（1∶200），Hochest 33258復染細胞核。

1.5 生物信息學預測 采用靶基因預測軟件miRanda(http:// www.microrna.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)對 miR-122和GATA4基因的靶向匹配關系進行預測。

1.6 miR-122靶基因GATA4的鑒定

1.6.1 GATA4 3′UTR的克隆 取誘導培養20 d的心肌樣細胞，加入RNAiso Plus提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度，用RNasefree水稀釋為1 g/L，按PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書，反轉錄為cDNA，利用正向引物5′-CCGAGCTCCCTGCCCTTGTCCAACACTC-3′和反向引物5′-GCTCTAGACCTTCTCCTCACCTAAACCC-3′擴 增 GATA4 mRNA的3′UTR片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明回收目的片段，克隆到pMD 18-T載體上，測序。

1.6.2 GATA4 3′UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體的構建 分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pmirGLO質粒載體以及回收得到的GATA4 3′UTR，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物及膠回收，按DNA Ligation Kit Ver 2.0說明，將回收的GATA4 3′UTR酶切片段與pmirGLO載體酶切片段相連，構建GATA4 3′UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體，轉化入DH5α感受態細胞中克隆擴增，按照AxyPrep質粒DNA小量試劑盒說明從菌液中提取重組質粒，用SacⅠ和XbaⅠ酶切質粒鑒定。

1.6.3 NIH3T3細胞轉染與熒光素酶檢測 NIH3T3細胞培養在含10%FBS的DMEM培養基中，轉染前1 d，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90%～95%。對于每孔細胞，利用Lipofectamine 2000轉染GATA4 3′UTR-pmir-GLO 200 ng以及miR-122模擬物或對照miRNA 30 nmol/L，轉染24 h后，按照Dual-Luciferase?報告基因檢測系統說明檢測不同處理組的熒光強度。每個處理設置3個重復，每個轉染實驗重復3次。

1.7 qRT-PCR檢測miR-122及GATA4的表達 取誘導5、9、13、17和21 d的細胞，分別加入RNAiso for small RNA或RNAiso Plus提取總miRNA或總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，紫外分光光度計檢測純度和濃度，用RNase-free水稀釋為1 g/L，按照One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit說明書反轉錄，得到的cDNA樣品稀釋4倍，加入SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ和miR-122檢測引物（通用檢測引物試劑盒自帶）或GATA4檢測引物，見表1，以U6或GAPDH為內參基因，在Chromo4TM多色實時定量PCR儀(Biorad)上進行40個循環的qPCR反應，應用Opticon-3軟件定量分析反應結果，miR-122和GATA4 mRNA的表達量分別用U6和GAPDH標準化。每次定量分析檢測樣品設置3個重復，以3批樣品進行獨立表達分析。

1.8 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件處理數據，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，兩變量關聯性應用Pearson相關進行分析，以P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 bMSCs流式細胞儀鑒定結果 大鼠bMSCs高表達間充質干細胞相關標志物CD29（90.12%）、CD44（94.62%）、CD166（63.27%），而造血干細胞標志物CD34（1.23%）表達陰性，見圖1。

2.2 誘導后細胞形態學觀察 bMSCs傳至3～4代，分布均勻，呈梭形，折光性強，見圖2A。誘導3周后細胞變細長，平行排列，緊密相連，形態規則均一，見圖2B；細胞免疫熒光顯示分化2周后細胞內有cTnI表達，顯示綠色熒光，見圖2C～E。

2.3 miR-122和GATA4靶向匹配關系預測結果 TargetScan結果表明miR-122在GATA4 mRNA的3′UTR上有1個哺乳動物間保守的靶位點，靶位點類型為7mer-m8，“context+score”百分數為56，其與靶位點互補情況良好。miRanda顯示miR-122與靶位點匹配的mirSVR得分為-0.143 7，miRNA與3′UTR結合情況良好，見表2。

2.4 miR-122可直接調控GATA4的表達 熒光強度分析結果顯示，將對照組miRNA（在小鼠細胞系中無任何靶基因）的熒光素酶活性設定為1時，miR-122組的熒光素酶活性為（53.74±6.38）%，差異有統計學意義（t=3.648，P=0.007）。

2.5 心肌樣細胞誘導分化的過程中miR-122和GATA4的表達關系 qRT-PCR結果顯示，將誘導5 d細胞mRNA的表達量值設為1時，誘導9 d GATA4 mRNA的表達量為4.54±1.82，誘導21 d時升至11.71±6.84，而miR-122的表達量誘導9 d下降為（57.76±7.57）%，誘導21 d下降至（23.86±5.64）%，見圖3。隨著誘導時間的延長，miR-122與GATA4表達水平呈負相關（n=8，r=-0.863，P=0.006）。

3 討論

GATA家族是具有鋅指結構的轉錄因子，目前已知有6個成員，因其識別序列(A/T)GATA(A/G)而得名，根據組織分布以及氨基酸序列同源程度分為2個亞家族：GATA1～3主要在造血系統中表達，而GATA4～6主要在內胚層和中胚層來源的組織中表達，如心臟、肝臟、消化系統和生殖腺等[5]。GATA4是近年來心血管領域的研究熱點，GATA4基因敲除小鼠由于心臟發育缺陷致胚胎期死亡[5]；過表達的GATA4可促進P19細胞向心肌細胞分化[6]。Ieda等[7]研究發現GATA4、Tbx5與MEF2c轉錄因子聯合作用可將心臟成纖維細胞及皮膚成纖維細胞誘導成為心肌樣細胞，而且，GATA4還能調控心臟成纖維細胞的增殖[8]。GATA4能調控Bcl基因發揮抗凋亡作用[9]。這些研究均證明GATA4是調控心臟發育以及心肌細胞增殖、分化和凋亡的重要轉錄因子。GATA4還是許多信號通路中MAPK激酶ERK和p38的下游靶標[10]。因此，GATA4是多種信號通路的整合者及下游效應分子，在心臟發育中發揮著重要的作用。

miRNA作為一類小的內源性非編碼RNA已被證實廣泛參與生命活動過程中的基因表達調控，但對于miRNA參與心肌樣細胞誘導分化方面卻知之甚少，為此，本研究運用靶基因預測軟件miRanda和TargetScan對miR-122和GATA4基因的靶向匹配關系進行預測，發現兩者匹配關系良好。miRanda是第一個靶基因預測軟件，其適用范圍寬廣，不受物種限制，除了傳統的miRNA與靶基因堿基互補方面的要求外，Betel等[11]更新了算法mirSVR，作為一種新的機器學習方法，mirSVR將預測的靶位點的序列和結構特征（contextual features）整合并建立回歸模型，不需要定義種子區亞類（seed subclasses）。然而，TargetScan是用于預測哺乳動物miRNA靶基因的軟件，其以靶基因跨物種保守和miRNA-靶基因二聚體熱力學特征為基礎，并首次引入假陽性率來評價靶基因預測結果。后來，Lewis等[12]將TargetScan優化為TargetScanS,把miRNA種子區修訂為5＇端第2到7位堿基，并根據靶位點與miRNA的互補情況，將靶位點分為3種類型：與miRNA種子區精確匹配且與miRNA第1位核苷酸對應處為A(7mer-1A sites)，與miRNA第2到8位精確匹配（7mer-m8 sites），與miRNA第2到8位精確匹配且與miRNA第1位核苷酸對應處為A（8mer sites）。

筆者進一步通過雙熒光素酶報告系統研究發現，miR-122能夠靶向作用于GATA4 3＇UTR抑制GATA4的表達。qRT-PCR結果表明，隨著誘導時間的延長，miR-122的表達量逐漸降低，而GATA4的表達量逐漸升高，兩者呈負相關，與熒光素酶報告系統檢測結果相符，提示miR-122參與了心肌樣細胞的誘導分化過程，其具體的調節機制及與其他幾種重要轉錄因子的關系還需進一步的研究。

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（2013-10-10收稿 2013-12-02修回）

（本文編輯 李國琪）

GATA4 Expression During Induction of the Cardiomyocyte-Like Cells Differentiation Regulated by miR-122

GUO Lijing,ZHANG Zhi,LIU Zidong,FU Wei,JI Zhou
Department of Cardiology,The Third Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China

ObjectiveTo identify the miR-122 which regulateing GATA4 expression during the induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells(bMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.MethodsBMSCs were isolated from bone marrow and induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The miR-122 which may regulate expression of GATA4 were predicted using miRanda and TargetScan softwares and identified by dual luciferase report system.The expressions of miR-122 and GATA4 were determined using q-PCR during the differentiation of bMSCs into cardiomyocyte-like cells.ResultsThe induced cells were completely in contacted with adjoining cells and uniform in shape and aligned parallelly.Cardiac troponin I(cTnI)expression was detected by immunofluorescence cytochemistry.Using dual luciferase reporter system in vitro,miR-122 were proved to be able to effectively inhibit GATA4 expression by binding the 3′UTR of GATA4 mRNA.q-PCR results showed that the expression of miR-122 is negatively correlated with that of GATA4 mRNA transcription.ConclusionThese results indicated that miR-122 regulate the expression of GATA4 during the induction of cardiomyocyte-like cells.

mesenchymal stem cells;MicroRNAs;GATA4 transcription factor;3′untranslated regions;computational biology;rats,Sprague-Dawley;miR-122;cardiomyocyte-like cells

Q522,R318.04

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.013

遼寧醫學院附屬第三醫院心內科（郵編121001）

△通訊作者 E-mail:ningcheng631@163.com