前列腺癌超聲微泡介導藥物及基因治療研究進展

劉 蕓 趙 云△ 劉朝奇 胡 兵

前列腺癌是男性高發(fā)的惡性腫瘤之一。常規(guī)去激素治療前列腺癌后多在12～18個月內發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate carcinoma，AIPC），目前臨床上對AIPC缺乏有效的治療方法。隨著分子生物學和基因技術的發(fā)展，基因治療顯得極具優(yōu)勢。然而，同其他腫瘤的基因治療一樣，前列腺癌離體細胞或動物實驗基因治療效果不盡理想，主要原因之一是缺乏安全高效的活體內基因運送載體。目前常用的非病毒載體存在轉染率低等問題，病毒載體雖轉染效率高，卻存在安全性低、免疫原性高、靶向性差等缺點。近年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡造影劑可作為一種新型的體內基因轉染載體，用于前列腺癌的治療研究，并有望為前列腺癌患者提供一種安全、高效的治療方法[1]。本文就載藥微泡在前列腺癌治療中的應用綜述如下。

1 超聲微泡造影劑

超聲微泡造影劑因具有回波反射性而應用于組織增強顯影,又因能促進質粒在細胞和組織中的轉運，而被用作基因運載體。其主要由內充氣體和外殼構成，內充氣體現(xiàn)多采用低溶解度的氣體，如氟碳氣體C3F8、C4F10或氟硫氣體SF6，其在血液中的循環(huán)時間及穩(wěn)定性明顯高于空氣核心的納米級超聲微泡；外殼多由糖類、變性的白蛋白、磷脂、聚合物或上述物質混合而成[2]。

2 超聲微泡的靶向性作用

超聲微泡可成為理想的藥物或基因載體的主要原因是，其可定向到達特定部位而發(fā)揮作用。超聲微泡的這一特性被稱為靶向性作用。而根據其實現(xiàn)靶向的機制和部位不同，可將其靶向作用分為被動型和主動型。被動型靶向是指通過機體本身的免疫－吞噬細胞在調理素的協(xié)同作用下實現(xiàn)對異物（超聲微泡）的清除；主動型靶向是指通過對超聲微泡的外殼進行特殊處理，如在其外殼表面裝配具有靶向性識別的各種配體（如抗體、糖類、多肽類），此類配體能特異性識別并結合病變組織細胞所表達的受體，從而達到靶向顯影，載藥、載基因靶向治療的目的[3]。

超聲微泡靶向性作用是其作為載體應用于臨床的基礎，為提高超聲微泡的靶向性，國內外學者做出了各方面的嘗試。Maul等[4]提出了雙重靶向的概念，在微泡上插入一個快速定位配體和一個穩(wěn)定性好、親和力高的緩慢定位配體,在提高微泡黏附率的同時，增強了微泡抗脫落的能力。Sun等[5]合成了陽離子超聲微泡（cationic microbubble,CMB），其攜AKT基因轉染缺血性心肌病的能力較普通微泡提高了近70%，經其治療后，心肌梗死范圍明顯縮小，心肌細胞凋亡率降低，心肌內微血管密度增加。Yan等[6]利用生物素－親和素連接方式將紫杉醇與脂質微泡結合起來，制備了紫杉醇-脂質微泡。該微泡在超聲輻照下可靶向作用于腫瘤，有效地促進了腫瘤細胞的凋亡，限制了腫瘤的生長。

3 超聲微泡攜藥物治療的作用機制

3.1 聲孔效應 聲孔效應是超聲微泡靶向治療的物理基礎。微泡在超聲激發(fā)下出現(xiàn)震蕩或內爆，并伴隨產生高速微束射流、巨大切應力和沖擊波等，致使細胞膜的完整性遭到破壞。在細胞膜甚至核膜上產生直徑約為50 nm暫時性、可逆性的小孔，此即聲孔效應。這些小孔可以允許分子質量在10～3 000 ku的物質通過細胞膜或核膜。在高強度超聲輻射或微泡濃度較高時，這種小孔可成變?yōu)橛谰眯缘男】祝沟眉毎麅韧鉂B透壓改變，最終導致細胞死亡，此即為致死性聲孔效應[7]。

3.2 空化效應 細胞膜通透性改變是基因轉染的前提。超聲在輻照中所產生的空化效應和機械效應可增強細胞膜的通透性，尤以空化效應為主。空化效應分為穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化。后者是一種強烈的生物效應，在增強基因的轉染的同時，甚至會引起細胞凋亡、壞死。Bazan-Peregrino等[8]的研究顯示，超聲的空化效應可使毛細血管內皮細胞間隙增寬和細胞膜通透性增加，從而使得微泡或釋放的基因能夠進入血管壁及組織間隙，發(fā)揮靶向治療作用。

3.3 其他作用 Meijering等[9]提出，超聲輻射下微泡破裂，導致過氧化氫大量生成，同時引起鄰近細胞膜Ca2+內流、Ca2+依賴性K+通道開放，從而致使局部膜電位發(fā)生超極化，該機制介導超聲微泡通過內吞作用和胞飲作用進入細胞內。Tran等[10]研究結果顯示，超聲微泡破裂產生的壓力可形成一種機械性刺激，活化特定通道(牽張激活通道)和非特異性離子通道，使外源性分子（如含轉染基因或藥物的微泡）進入細胞內而發(fā)揮作用。

4 超聲微泡介導藥物治療前列腺癌的研究進展

4.1 超聲微泡介導與腫瘤細胞凋亡 Li等[11]在超聲引導下用磷脂微泡攜帶羥基喜樹堿作用于腫瘤小鼠。Fan等[12]利用超聲輻照下攜載survivin siRNA的納米級微泡治療前列腺癌，通過基因沉默抑制survivin在前列腺癌C4細胞及DU-145細胞中的表達，而誘導細胞的凋亡，達到顯著的抑癌效果。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)，對前列腺癌小鼠進行超聲微泡結合放射性治療，腫瘤細胞凋亡率明顯增加。

4.2 超聲微泡介導與腫瘤新生血管的損傷 腫瘤的迅速生長依賴于從新生血管內獲取足夠多的營養(yǎng)。腫瘤新生血管內皮會表達大量的黏附分子受體、生長因子受體（如整合素αvβ3和血管內皮生長因子）等，它們在腫瘤毛細血管及細胞中表達，而在正常細胞中表達甚微，因此，其可作為微泡治療腫瘤的良好靶點。Anderson等[14]將環(huán)狀五肽cRGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）連接在微泡表面制成cRGD-MB，以靶向結合αvβ3整合素,與對照組相比，cRGD-MB組具有顯著吸附αvβ3整合素的能力，靶向作用于腫瘤的能力更強。Negi? shi等[15]從層黏連蛋白a1鏈中分離得到了含12個氨基酸的AG73多肽鏈，合成了AG73脂質超聲微泡（AG73-Bubble li?posomes，AG73-BLs）,AG73-BLs能與腫瘤血管內皮中高表達的硫酸類肝素蛋白多糖（syndecan-2）特異性結合，從而實現(xiàn)定向黏附腫瘤血管內皮的作用,AG73-BLs組較未標記組或其他微泡修飾組，靶向性更強，且持續(xù)作用時間可達4 min。Hwang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡造影劑在低頻超聲輻照下會損傷腫瘤新生血管內皮，并激活內源性和外源性凝血，誘發(fā)血管內血栓形成，栓塞毛細血管，引起局部腫瘤組織缺血、壞死。

4.3 超聲微泡介導與藥物的運輸 超聲微泡在靶向治療腫瘤獨具優(yōu)勢主要體現(xiàn)在兩個方面，一是高特異性(通過配體-受體結合)地將基因或藥物運送至腫瘤部位，二是在特定參數的超聲輻照可促進腫瘤細胞對化療藥物的攝取，這點在化療中尤為重要。Jackson等[17]將超聲參數設定為4 MHz和平均聲強為32 W/cm2時，腫瘤細胞和血管內皮細胞對親水性微泡造影劑（若丹明R123，親水性阿霉素和甘露醇）和疏水性微泡造影劑（若丹明R6G和紫衫醇）的攝取率均升高，由納米微粒封閉紫杉醇的吸收率近達100%。Bai等[18]將超聲參數設定為21 kHz、聲強為4.6 mW/cm2時，脂質微泡＋pEGFP+超聲組中，pEGFP DNA對PC-3細胞的轉染率達到了20.30%，其轉染率為pEGFP直接轉染組的81倍。Liu等[19]在對兔前列腺癌進行超聲輻照下微泡治療（microbubble-enhanced thera?peutic ultrasound，MEUS）后，注射伊文斯藍（Evans blue，EB）和硝酸鑭（lanthanum，La），并計算EB及La在腫瘤組織中的滲出率，以評估MEUS治療前列腺癌的效果。結果顯示，在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM)下EB滲出率增加，并廣泛分布于微血管基質及腺上皮。透射電子顯微鏡（TEM）顯示血管內皮細胞間的緊密連接被打開，并見La在基質和腺上皮分布。該實驗表明MEUS可以提高前列腺癌的滲出率，并能打開血-前列腺癌屏障。

5 問題與展望

隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，超聲微泡可通過各種修飾、裝配，而成為介導前列腺癌基因治療的主要工具。但目前這些研究大都處于臨床前的動物實驗階段，在其進入臨床試驗之前仍需解決以下問題：（1）微泡制備技術及將藥物、基因或配體連接至微泡上的技術尚不成熟。微泡攜帶基因或藥物量有限，同時，微泡在血管內運輸時因血液具有流動性與沖擊性，導致微泡與受體接觸時間短，靶向微泡-受體對形成數量不足，往往處于治療閾值以下。（2）超聲微泡爆裂時，除了能使血管內皮間隙增寬而促進基因轉染外，還可引起血管內皮細胞損傷、血小板激活、血管內溶血等不良反應。（3）超聲參數設定對于微泡的轉染率有一定的影響，但仍未形成最優(yōu)參數。

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