多糖的化學修飾對其生物活性影響研究進展

孟思彤，徐艷芝，王振月*

1黑龍江中醫藥大學;2 哈藥集團三精制藥股份有限公司，哈爾濱 150040

多糖在自然界蘊藏豐富，種類繁多，具有抗腫瘤、抗氧化和免疫調節等眾多生物活性且其副作用低而引起研究者廣泛關注并獲得很大進展［1-3］，多糖生物活性的發揮與其結構有關，很多研究發現經化學修飾后多糖生物活性明顯增強或產生新的活性，在保持健康和預防疾病方面產生了極好的生理特性［4，5］，如天然香菇多糖具有抑制腫瘤的作用，而硫酸化后顯示出較高的抗HIV 的活性，因此多糖的分子修飾和結構改造具有重要意義。本文對多糖化學修飾的常見方法硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、羧甲基化等及其對生物活性影響進行闡述。

1 化學修飾方法

1.1 硫酸化

硫酸化修飾是多糖修飾中常見的方法之一，硫酸化的修飾方法主要有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法等，其修飾結果是將硫酸基團加到多糖的糖基上，增加其生物活性。研究表明，硫酸的取代度、取代位置、碳水化合物含量等對硫酸酯化多糖活性有一定影響。

1.2 磷酸化

多糖分子經磷酸化修飾后，支鏈上的羥基被磷酸基團取代，增強原多糖水溶性，改變鏈構象，磷酸多糖衍生物有減輕心功能不全癥狀、抗炎、抗氧化、抗菌免疫、抗腫瘤等功能。

1.3 羧甲基化

羧甲基化是向多糖分子引入羧甲基，使部分生物活性受影響。大多數有生物活性的多糖都是水溶的，難溶水的一部分通常認為沒用。提高多糖的水溶性是促進多糖活性的很重要部分。廣泛認為羧甲基化可以增加多糖的水溶性。

1.4 乙酰化

乙酰化是將多糖支鏈上羥基被乙?；鶊F取代，使多糖結構伸展，讓更多的羥基暴露出來，會導致它在水中的溶解度增加，提高其活性，是一種常用的多糖修飾方法。

1.5 烷基化

目前研究較多的是殼聚糖的烷基化，殼聚糖系甲殼素脫乙?；漠a物，這種高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優良性能被各行各業廣泛關注，烷基化的殼聚糖有極好的水溶性，有強溶菌酶降解和自身降解能力。對于制備水溶性好、可生物降解的殼聚糖衍生物有一定意義［6］。

1.6 硒化

硒化多糖是由硒和多糖組成，有雙重藥理作用，然而又不是兩種活性的簡單相加，硒化多糖會比它們產生更高或更新的活性。大量研究發現硒化多糖免疫增強活性與最佳硒化度的協同作用和碳水化合物含量有關。

2 生物活性影響

2.1 抗病毒活性

Yu Lu 采用CSA-Pyr 硫酸修飾法，這個方法中氯磺酸與吡啶濃度比、反應時間和反應溫度是重要影響因素，將三個因素加以考慮進行正交設計，得到9 種硫酸化淫羊藿多糖。結果證實硫酸化的淫羊藿多糖對雞胚成纖維細胞抵抗雞傳染性法氏囊病毒感染的作用顯著增強，且其能力與硫酸基取代度和碳水化合物含量有一定的相關性［7］。較低濃度的硫酸化牛膝多糖與沒經化學修飾的牛膝多糖比，硫酸化牛膝多糖(在MARC-145 細胞上)有顯著的抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的作用［8］。Tiehong Yang 等研究了硫酸化當歸多糖APSs 在白血病病毒感染的小鼠體內的活性，病毒復制被抑制，六種不同硫酸化程度的衍生物在濃度10～30 mg/kg 時抑制率從26%到30%。當APS-1 在濃度為3～30 mg/kg 時，外周血細胞中CD4+細胞數量、CD4+/CD8+比值明顯增強，即加強了免疫功能。此外因感染病毒而減少的胸腺體重量指標升高。這個類似患AIDS 的鼠模型與感染AIDS 的人類有很多相似的地方，如免疫缺陷、病毒復制、腫瘤發生。因此此實驗結果可適用于人類AIDS 研究上［9］。用MTT 法檢測兩種硫酸化銀耳多糖和三種沒經過化學修飾的銀耳多糖對感染NDV 病毒細胞的效果，結果顯示硫酸化銀耳多糖明顯提高抗NDV 病毒能力［10］。Uryu 等最先將烷基引入到硫酸低聚糖，合成了如硫酸十八烷麥芽醇己糖苷、硫酸十二烷昆布戊糖苷和硫酸十二烷昆布寡聚物。發現烷基化修飾后的硫酸低聚糖的抗HIV 活性遠遠高于修飾前的多糖［11］。大量實驗證明了多糖衍生物抗病毒作用增強與化學集團取代度有關，同時聚合度、基團位置、聚合物骨干等結構因素也會影響抗病毒活性，化學集團的引入改變多糖三維構象，從而影響其活性。

2.2 抗腫瘤活性

Wei 等合成了四種硫酸取代度不同的紅芪多糖，硫酸基團主要修飾C-2 和C-6 位置。與紅芪多糖較低的效果相比，硫酸化的紅芪多糖在體外實驗中對A549 細胞和BGC-823 細胞有更高的抑制率，表明硫酸化的紅芪多糖有更好的抗腫瘤活性。流式細胞術表明硫酸化紅芪多糖調節A549 和BGC-823細胞在G1 階段細胞周期阻滯，抑制細胞增長及誘發細胞凋亡。且與常見治療癌癥的藥物不同，紅芪多糖和硫酸化的硫酸化多糖對非癌癥細胞HEK293均沒有細胞毒性作用［12］。將有獨特結構–［3GlcAβ1-4 (GalNAcα1-3)-Fucα1］n 的烏賊墨多糖硫酸化，結構變為–［3GlcAβ1-4 (4，6-SO4-GalNAcα1-3)-Fucα1］n–在體外肝癌細胞HepG2上產生劑量依賴的抑制細胞入侵和轉移作用。而且在雞胚尿囊膜模型中，明顯抑制血管新生［13］。硫酸化的脫脂米糠多糖在體外有明顯抑制B16 細胞和HepG2 細胞增長的作用。當硫酸取代程度在0.81到1.29 范圍內、碳水化合物含量在41.41%到78.56%之間時，其抗腫瘤作用相對較強［14］。磷酸化的茯苓(1→3)-β-D-葡聚糖在溶液中存在一個相對延伸柔性鏈。體外實驗中有抗腫瘤活性，在體內對S180細胞有較強的抑制率，而茯苓葡聚糖則沒有這個生物活性。或許是磷酸基團、較高的分子質量、相對擴展的構象增加與免疫細胞受體結合的機會，從而增強抗腫瘤活性［15］。將茯苓中β-(1→3)-D-葡聚糖(PCS3-II)羧甲基硫酸化后(CS-PCS3-II)，在溶液中有一條擴展的柔性鏈。CS-PCS3-II 在老鼠體內對S180腫瘤細胞抑制率比PCS3-II 有顯著提高，顯微鏡觀察腫瘤細胞有壞死和凋亡的跡象。免疫增強是因為硫酸和羧甲基基團通過結合氧、靜電吸引與免疫細胞受體接觸增多，達到一個更強大的免疫反應，從而抑制腫瘤細胞擴散。此外，噬菌細胞、胸腺指標、脾臟指標都有顯著增多。溶血活性、脾臟抗體產生、遲發型超敏反應表明在老鼠體內CS-PCS3-II 能顯著增強免疫保護功能［16］。多糖的抗腫瘤活性與結構有關，大量實驗證明了許多多糖衍生物抗腫瘤作用增強，主要機制為抑制腫瘤細胞增長、誘發其凋亡、抑制其轉移和入侵等作用。

2.3 免疫作用

Junmin Wang 等將寧夏枸杞多糖硫酸化配合ND 免疫雛雞，在一免后28 d 內能顯著促進淋巴細胞增殖、增強血清抗體效價、加強免疫力［17］。硫酸化香菇多糖減少NDV 雛雞的發病率和死亡率，高劑量可增強抗體效價，低劑量促進淋巴細胞增殖效果更好，比香菇多糖效果明顯。硫酸化香菇多糖可增加香菇多糖的佐劑性，提高NV 疫苗的免疫效力［18］。將三種硫酸取代度不同，其中碳水化合物含量、分子質量、氯磺酸與吡啶濃度比均不同的硫酸化柿子多糖進行體外脾淋巴細胞增殖實驗，結果表明硫酸化多糖能促進細胞因子的產生及NO 釋放，使脾淋巴細胞激活性顯著提高［19］。硫酸化多糖衍生物產生增強抗體效價、促進淋巴細胞增殖、提高淋巴細胞激活性等作用，使其免疫作用明顯增強。在注射新城疫病毒疫苗的雛雞體內，硒化當歸多糖與沒經化學修飾的當歸多糖相比可以明顯促進周圍淋巴細胞增殖、增加血清抗體效價、IFN-γ、1L-6 含量。根據三個因素(Na2SeO3量、反應溫度、反應時間)正交得到9 種硒化衍生物sCAPs，其中sCAP2 效力最強，可能與最佳的硒化程度和碳水化合物含量有關［20］。

2.4 抗氧化

硫酸化的柿子多糖有呈劑量依賴的還原反應，DPPH 清除、超氧陰離子清除、羥基清除。三種柿子多糖衍生物(硫酸化取代度分別為0.8、1.7、2.5)中，硫酸化程度高的效果最好。硫酸根基團使端基碳的氫原子活潑、增加多糖聚合電解質和親核性、增加與金屬鐵的接觸，從而增強清除力。多糖的清除能力取決于其結構參數，如分子質量、水溶性、取代基團、取代位置、取代程度、糖種類、糖苷分支。對這些條件進行優化也是增強多糖抗氧化力的途徑［21］。硫酸化白沙嵩多糖抗氧化提高，其機制可能是由于其強供氫能力、與金屬螯合能力、除超氧自由基效力。高硫酸取代度和適當的分子質量能加強其抗氧化性［22］。黑木耳作為藥物食物有1000 多年，有很多生物活性。黑木耳粗多糖水溶性差，很難純化及進一步研究。但羧甲基化的黑木耳多糖水溶性增強，其氧化性與黑木耳粗多糖相比增強，如羥基消除、DPPH 自由基消除和ABTS +自由基消除，特別是后兩個實驗，氧化性幾乎為沒經化學修飾的黑木耳多糖的兩倍［23］。靈芝多糖羧甲基化增加了其水溶性，而且還發現了它有很高的氧化性，特別是清除羥基自由基、過氧化氫，一定程度上清除超氧陰離子團。而靈芝多糖的這些活性表現的很微弱［24］。乙?；瞎隙嗵窃贒PPH 自由基清除實驗、超氧陰離子自由基活性測定實驗、還原能力測定實驗中都顯示出比南瓜多糖更高的氧化性，且其氧化能力和取代度有很大關系，可能結構參數取代度、分子量不同而導致不同的抗氧化性，該實驗加入吡啶催化劑可以增加取代度，而酸酐量幾乎沒有影響。南瓜多糖及其乙?；苌锒伎梢种七^氧化氫誘導小鼠胸腺淋巴細胞的細胞凋亡和細胞死亡，乙?；瞎隙嗵潜憩F出更好的防護作用。在體內和體外的實驗都說明了乙酰化南瓜多糖有較強的抗氧化性［25］。然而Shao 從裂片石莼中分離的四種硫酸多糖抗氧化性差異表現和很多實驗結果不同，兩種硫酸含量低的多糖氧化性高于另兩種硫酸含量高的多糖。也許是裂片石莼多糖抗氧化活性不是一個因素決定的，而是由幾個因素共同決定:如分子質量、糖醛酸含量、蛋白質含量［26］。分析實驗不同結果可見，多糖抗氧化力并不是一個因素決定的，而是由多因素共同決定。研究不同多糖抗氧化作用機制，優化硫酸化反應實驗條件，找到合適的硫酸化衍生物，對研究其性能優勢至關重要。

2.5 抗凝血作用

肝素是迄今為止使用時間最長的硫酸多糖。通常，硫酸化多糖有抗凝血作用是因為和肝素有相似的結構和抗凝血機制一致。盡管肝素已經廣泛用于抗凝血治療60 多年，但它在臨床應用上有很多問題，比如對抗凝血酶不足病人無效，生物利用度低，出血的風險以及在一些肝素接受者身上引起的血小板減少癥［27-30］。近年來根據肝素抗凝血機理制備的低副作用硫酸化多糖受到廣泛關注。Lihong Fan首次采用三磺化十二胺作為硫酸化試劑在水溶液中制備蘋果果膠硫酸鹽。果膠硫酸鹽能通過抑制抗凝血酶延長部分凝血活酶時間和凝血酶時間［31］。硫酸多糖衍生物的制備與探尋為尋找新的副作用更小的抗凝血藥物有很大意義。

2.6 抗炎

硫酸黃芪多糖劑量依賴的上調緊密蛋白如閉合蛋白、ZO-1 的mRNA 表達，下調促炎因素如TNF-α、1L-1β、1L-8 的mRNA 表達，保護了LPS 感染的Caco2 細胞。體外研究表明硫酸化的黃芪多糖抗炎效果優于黃芪多糖［32］。

2.7 降血脂作用

硫酸化孔石莼多糖與孔石莼多糖相比，前者使小鼠體內的甘油三酸酯、低密度脂蛋白濃度明顯下降［28.1%(P＜0.05)和28.4%(P＜0.01)］。結果顯示硫酸化孔石莼多糖有更高的抗高血脂效果且降血脂活性沒有濃度依賴。作用機制尚不明確，前期研究表明硫酸化孔石莼多糖比石莼多糖有更高的抗氧化性，其降血脂活性可能與抗氧化活性有關［33］。

3 小結

多糖的生物活性大多與其結構密切相關，多糖主鏈各糖單元組成、糖苷鍵類型均直接決定了多糖的活性，多糖支鏈的類型、聚合度、支鏈在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖的活性大小，同時多糖生物活性很大程度取決于其分子質量，多糖分子的高級結構如鏈的柔韌性和空間構象與多糖活性緊密相關，為提高多糖的生物活性，多糖的分子修飾和結構改造具有重要意義。利用化學修飾法向多糖中引入新的基團從而增加或增強多糖的生物活性，且多糖類化合物大多沒有毒性，使多糖及其衍生物在功能食品、藥品、藥妝領域等方面有更大的開發潛力。隨著多糖結構修飾方法的完善、科學技術水平不斷提高以及生命學科等領域的發展，多糖以及多糖衍生物的研究將會不斷深入，科研工作者將會開發出更多更好的多糖類化合物，從而使糖化學研究運用到人類生活中。

1 Cui FJ，Tao WY，Xu ZH，et al.Structural analysis of antitumor heteropolysaccharide GFPS1b from the cultured mycelia of Grifola frondosa GF9801.Biores Technol，2007，98:395-401.

2 Cooi VE，Liu F.Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes.Curr Med Chem，2000，7:715-729.

3 Zhao Z，Li J，Wu X，et al.Structures and immunological activities of two pectic polysaccharides from the fruits of Ziziphus jujuba Mill.cv.jinsixiaozao Hort.Food Res Int，2006，39:917-923.

4 Baba M，Snoeck R，Pauwels R，et al.Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses，including herpes simplex virus，cytomegalovirus，vesicular stomatitis virus，and human immunodeficiency virus.Antimicrob Agents Ch，1988，32:1742-1745.

5 Veena CK，Josephine A，Preetha SP，et al.Beneficial role of sulfated polysaccharides from edible seaweed Fucus vesiculosus in experimental hyperoxaluria.Food Chem，2007，100:1552-1559.

6 Ma G，Yang D，Zhou Y，et al.Preparation and characterization of water-soluble N-alkylated chitosan.Carbohydr Polym，2008，74:121-126.

7 Lu Y，Wang D，Hu Y，et al.Sulfated modification of epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV.Carbohyd Polym，2008，71:180-186.

8 Liu C，Chen H，Chen K，et al.Sulfated modification can enhance antiviral activities of Achyranthes bidentata polysaccharide against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)in vitro.Int J Biol Macromol，2013，52:21-24.

9 Yang T，Jia M，Zhou S，et al.Antivirus and immune enhancement activities of sulfated polysaccharide from Angelica sinensis.Int J BiolMacromol，2012，50:768-772.

10 Zhao X，Hu Y，Wang D，et al.Optimization of sulfated modification conditions of tremella polysaccharide and effects of modifiers on cellular infectivity of NDV.Int J Biol Macromol，2011，49:44-49.

11 Uryu T，Ikushima N，Katsuraya K，et al.Sulfated alkyloligo saccharideswith potent inhibitory effects on human immunodeficiency virus infection.Biochem Pharmacol，1992，43:2385-2392.

12 Wei D，Wei Y，Cheng W，et al.Sulfated modification，characterization and antitumor activities of Radix hedysari polysaccharide.Int J Biol Macromol，2012，51:471-476.

13 Chen S，Wang J，Xue C，et al.Sulfation of a squid ink polysaccharide and its inhibitory effect on tumor cell metastasis.Carbohydr Polym，2010，81:560-566.

14 Wang L，Li X，Chen Z.Sulfated modification of the polysaccharides obtained from defatted rice bran and their antitumor activities.Int J Biol Macromol，2009，44:211-214.

15 Chen X，Xu X，Zhang L，et al.Chain conformation and antitumor activities of phosphorylated (1→3)-β-D-glucan from Poria cocos.Carbohydr Polym，2009，78:581-587.

16 Chen X，Zhang L，Cheung PCK.Immunopotentiation and antitumor activity of carboxymethylated-sulfated β-(1 →3)-dglucan from Poria cocos.Int Immunopharmacol，2010，10:398-405.

17 Wang J，Hu Y，Wang D，et al.Sulfated modification can enhance the immune-enhancing activity of Lycium barbarum polysaccharides.Cell Immunol，2010，263:219-223.

18 Guo Z，Hu Y，Wang D，et al.Sulfated modification can enhance the adjuvanticity of lentinan and improve the immune effect of ND vaccine.Vaccine，2009，27:660-665.

19 Zhang Y，Lu X，Zhang Y，et al.Sulfated modification and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharides derived from fresh Chinese persimmon fruit.Int J Biol Macromol，2010，46:67-71.

20 Qin T，Chen J，Wang D，et al.Selenylation modification can enhance immune-enhancing activity of Chinese angelica polysaccharide.Carbohydr Polym，2013，95:183-187.

21 Zhang Y，Lu X，Fu Z，et al.Sulphated modification of a polysaccharide obtained from fresh persimmon (Diospyros kaki L.)fruit and antioxidant activities of the sulphated derivatives.Food Chem，2011，127:1084-1090.

22 Wang J，Guo H，Zhang J，et al.Sulfated modification，characterization and structure-antioxidant relationships of Artemisia sphaerocephala polysaccharides.Carbohydr Polym，2010，81:897-905.

23 Yang L，Zhao T，Wei H，et al.Carboxymethylation of polysaccharides from Auricularia auricula and their antioxidant activities in vitro.Int J Biol Macromol，2011，49:1124-1130.

24 Xu J，Liu W，Yao W，et al.Carboxymethylation of a polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum enhances its antioxidant activities in vitro.Carbohydr Polym，2009，78:227-234.

25 Song Y，Yang Y，Zhang Y，et al.Effect of acetylation on antioxidant and cytoprotective activity of polysaccharides isolated from pumpkin (Cucurbita pepo，lady godiva).Carbohydr Polym，2013，98:686-691.

26 Shao P，Chen M，Pei Y，et al.In vitro antioxidant activities of different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata.Int J BiolMacromol，2013，59:295-300.

27 Beijering RJ，ten Cate H，ten Cate JW.Clinical applications of new antithrombotic agents.Ann Hematol，1996，72:177-183.

28 Sun Z，He Y，Liang Z，et al.Sulfation of (1→3)-β-d-glucan from the fruiting bodies of Russula virescens and antitumor activities of the modifiers.Carbohydr Polym，2009，77:628-633.

29 Martinichen-Herrero JC，Carbonero ER，Gorin PAJ，et al.Anticoagulant and antithrombotic activity of a sulfate obtained from a glucan component of the lichen Parmotrema mantiqueirense Hale.Carbohydr Polym，2005，60:7-13.

30 Alban S，Schauerte A，Franz G.Anticoagulant sulfated polysaccharides:Part I.Synthesis and structure-activity relationships of new pullulan sulfates.Carbohydr Polym，2002，47:267-276.

31 Fan L，Gao S，Wang L，et al.Synthesis and anticoagulant activity of pectin sulfates.J Appl Polym Sci，2011，124:2171-2178.

32 Wang X，Wang S，Li Y，et al.Sulfated Astragalus polysaccharide can regulate the inflammatory reaction induced by LPS in Caco2 cells.Int J Biol Macromol，2013，60:248-252.

33 Qi H，Huang L，Liu X，et al.Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta).Carbohydr Polym，2012，87:1637-1640.