三種抗生素對土壤呼吸和硝化作用的影響

楊基峰，應光國，賴華杰，趙建亮，劉珊，周麗君

1. 中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室，廣東 廣州510640；

2. 湖南文理學院化學化工學院，湖南 常德 415000；3. 湖南大學化學化工學院，湖南 長沙410082

三種抗生素對土壤呼吸和硝化作用的影響

楊基峰1,2,3，應光國1*，賴華杰1，趙建亮1，劉珊1，周麗君1

1. 中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室，廣東 廣州510640；

2. 湖南文理學院化學化工學院，湖南 常德 415000；3. 湖南大學化學化工學院，湖南 長沙410082

抗生素廣泛用于人體和動物疾病治療，但使用后大部分以母體形式排除體外，通過污泥還田、污灌及其他各種途徑進入土壤環境，對陸生生態環境產生潛在威脅。為評價抗生素對土壤微生物活性和功能的影響，以3種不同抗生素（磺胺嘧啶、氧四環素和諾氟沙星）為靶標化合物，采用OECD標準土壤呼吸實驗和氮硝化實驗方法，運用SPSS軟件對實驗結果進行統計分析，考察抗生素對土壤微生物活性和氮轉化功能的影響。實驗結果顯示：在呼吸實驗中，磺胺嘧啶和氧四環素在初始階段對土壤呼吸具有一定的抑制作用，并且氧四環素的抑制強度低于磺胺嘧啶，其最高抑制率分別為76.8%和20.7%；在實驗后期則出現一定激活作用，最高激活率分別為343%和218%，隨著時間的推移激活效應減弱。諾氟沙星在呼吸實驗初期對微生物活性出現激活作用，最高激活率為15.4%；后期則出現一定的抑制作用，最高抑制率為21.9%。在硝化實驗中，磺胺嘧啶對土壤A的微生物硝化作用在各處理之間未出現顯著性差異，而對土壤B則具有一定抑制作用，最高抑制率為20%；氧四環素和諾氟沙星則相反，在土壤A中對微生物硝化作用的抑制率分別為50%和19%，這種硝化作用差別性可能是由于土壤pH值和抗生素本身的抗菌譜所引起。通過以上實驗結果可得出如下結論：3種不同類型的抗生素對土壤的微生物活性和氮轉化功能會產生不同的作用，這種不同主要來自于抗生素種類、土壤類型及抗生素的濃度等因素的影響。因此，土壤中抗生素的引入將可對陸生生態環境造成一定影響，在實際糞便還田過程中應開展風險評估。

抗生素；土壤；呼吸作用；硝化作用

抗生素常用于預防和治療人體和動物疾病，也作為動物的生長促進劑。抗生素使用后，很大一部分以母體或具活性代謝產物形式排出體外，殘留于糞便中。如張樹清等（2005）對中國7省的典型規模化養殖場畜禽糞便中抗生素進行分析，其中豬糞中土霉素的平均質量分數為9.09 mg·kg-1，最高達135 mg·kg-1；四環素的平均質量分數為5.22 mg·kg-1，最高為78.6 mg·kg-1；金霉素平均質量分數為3.57 mg·kg-1，最高為122 mg·kg-1。糞便中含有植物所需要的氮、磷和鉀等營養元素，在傳統農業耕作中常作為肥料施入土壤，以提高農作物的產量。與此同時，糞便中所含的抗生素也隨之進入土壤環境中。研究表明：在中國檢測到土壤中含有土霉素的可高達200 mg·kg-1（王冉等，2006），而通過糞便形式進入土壤的抗生素每公頃可達數公斤（Kemper, 2008）。由于一些抗生素在環境條件下的消解速率緩慢，以及糞便的連續輸入，造成在土壤中抗生素的濃度較高。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，對物質的循環和土壤肥力的形成具有重要意義。由于抗生素對微生物具有一定的抑制甚至殺死作用，對土壤微生物數量、活性以及功能產生一定影響。因此，抗生素對土壤微生物的影響最終會波及整個土壤生態系統。土壤呼吸作用和土壤氮轉化能力是衡量土壤微生物活性的重要指標，二者的動態變化直接反應了土壤生態系統功能變化（Malchair and Carnol, 2009）。Kong等（2006）研究發現土霉素對土壤微生物群落功能多樣性的抑制率達20%，抑制作用最大的濃度為43 μmol·L-1，隨著濃度的增加抑制率反而略有下降。劉鋒等（2009）研究了抗生素對土壤微生物呼吸的影響，發現磺胺甲嘧啶、磺胺甲惡唑、氯四環素、四環素、泰樂素和甲氧芐啶對土壤呼吸的最大抑制率分別為34.3%、34.4%、2.71%、3.08%、7.13%和38.1%，并表現出劑量依賴效應。

目前雖對抗生素對土壤微生物功能開展一定研究，當關于不同抗生素對土壤氮硝化作用和土壤性質在抗生素對土壤微生物功能方面的影響研究較少。因此，本實驗以土壤呼吸作用和土壤氮硝化能力為指標，研究磺胺嘧啶、氧四環素和諾氟沙星對土壤微生物活性的影響，同時考察不同土壤性質對抗生素作用的影響，實驗的研究結果將為抗生素的陸生生態風險評價提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 化學品

磺胺嘧啶標樣（純度為99.5%）購自美國IL公司；氧四環素（純度為98.5%）和諾氟沙星標樣（純度為98%）購自南京德寶生化有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 供試土壤

本實驗用土采自從不同地點的0～20 cm表層土壤，去除樹枝等雜質，風干后過2 mm篩，用密封袋封存后置于4 ℃下，備用。土壤的理化性質見表1。

1.3 實驗方法

呼吸實驗方法參照OECD（2000a），氮轉化實驗參照OECD（2000b）標準方法。

1.4 數據的處理

實驗數據用Excel處理，Duncan檢驗采用SPSS統計軟件處理。

表1 土壤的理化性質Table 1 Physicochemical property of the two soils

表2 抗生素對土壤呼吸作用的影響Table 2 The effect of antibiotics on respiration of soils CO2mg·100 g干土-1

2 實驗結果

2.1 磺胺嘧啶對土壤呼吸強度的影響

經過21 d的培養，土壤呼吸強度結果見表2。由表2可看出，在土壤A中0～2 d內與對照土壤比較，磺胺嘧啶質量分數低（1.0～10.0 mg·kg-1）的土壤呼吸強度未發生顯著變化；在高質量分數下（50.0～200 mg·kg-1）土壤呼吸強度表現為抑制作用，且隨著含量的提高，抑制程度也相應地增強；當土壤中磺胺嘧啶添加質量分數為200 mg·kg-1時，其抑制強度達到76.8%。在2～4 d內50和100 mg·kg-1的土壤呼吸強度表現出強烈的激活作用，激活作用分別為68.3%和64.2%，且這兩者之間處于同一水平。其他處理土壤與對照相比，呼吸強度未表現出任何抑制作用。在4～8 d內，在低質量分數下（1～10 mg·kg-1），呼吸強度基本未發生顯著變化，而高質量分數下，其呼吸強度進一步被激活，當質量分數為200 mg·kg-1時，其激活強度高達343%。在8～14d內低質量分數（除1 mg·kg-1）呼吸強度沒有明顯改變；而在高質量分數下，雖然表現為激活作用，但其強度減弱，最高僅為101%（200 mg·kg-1）。在最后的7 d培養時間里，與對照相比，僅1 mg·kg-1土壤未表現出任何抑制和激活作用，其他處理土壤均表現出一定的激活作用。

在土壤B中0～2 d內，與對照相比，幾種處理土壤呼吸強度表現出抑制作用，而且隨質量分數的增加抑制作用更強；在200 mg·kg-1土壤中其抑制率達29.7%。在2～4 d內低質量分數（1和5 mg·kg-1）處理土壤的呼吸抑制作用解除；而在高質量分數下其抑制作用反而增加，抑制率最高達到68.4%。在4～8 d內10和50 mg·kg-1土壤的呼吸強度明顯被激活，激活率分別達到65.4%和158%，而其他處理土壤均未表現出任何抑制或激活效應。在8～14 d內與對照處理相比，低質量分數（1、5和10 mg·kg-1）土壤呼吸強度均未發生明顯變化，而在高質量分數下表現出強烈的激活作用，其最高激活率達到324%。在14～21 d內100和200 mg·kg-1土壤呼吸強度仍表現出強烈的激活作用，而其他處理土壤和對照相比，呼吸強度未發顯著變化。

從總體來看，磺胺嘧啶在初始階段對土壤呼吸作用具有一定的抑制作用，而在后期則具有一定激活作用，這與其他研究結果相似（Kotzerke等，2008；Thiele-Bruhn和Beck，2005）。Kotzerke等（2008）研究發現在前4 d內，2種濃度的磺胺嘧啶對土壤K的呼吸產生抑制作用，而在土壤M中僅高濃度產生抑制；但無論怎樣，在第32天后所有抑制作用都解除。由于磺胺嘧啶在土壤中消解速率較快，并且可能與土壤形成結合殘留。當磺胺嘧啶添加至土壤后，土壤的呼吸作用受到一定程度的抑制，隨著時間的延長磺胺嘧啶逐漸消減并與土壤形成結合殘留，其抑制作用解除。而且，土壤微生物能夠降解磺胺嘧啶，能夠利用磺胺嘧啶作為碳源或能源。因此，在實驗后期磺胺嘧啶對土壤呼吸具有一定激活作用。

2.2 氧四環素對土壤呼吸強度的影響

氧四環素對土壤呼吸強度的影響結果見表1。由表1可以看出，土壤A中0～2 d內低質量分數（1 mg·kg-1和5 mg·kg-1）的處理土壤呼吸強度未發生明顯變化；而高質量分數下土壤呼吸強度受到輕微的抑制作用，最高抑制率為20.7%。在2～4 d內10和100 mg·kg-1處理土壤強度表現出輕微的激活效應，激活率分別為16.5%和12.3%。其他處理與對照相比，呼吸強度未發生顯著變化。在4～8 d各處理土壤均表現出一定的激活作用，激活作用最強的為200 mg·kg-1土壤。在隨后培養時間氧四環素對土壤呼吸強度影響較小。在土壤B中，在前4天的培養時間里，與對照土壤相比，僅200 mg·kg-1土壤的呼吸強度受到一定程度的抑制作用，抑制率為15.2%。在4～8 d高質量分數處理土壤呼吸強度均表現出激活作用，最高激活率為194%。在隨后的培養時間里，土壤呼吸強度的激活作用逐漸減弱。這主要是由于隨著時間的延長，氧四環素通過吸附和降解作用，其生物有效性降低（Halling-Sφrensen等，2002）。如Hund-Rinke等（2004）將土壤培養8周后進行實驗，當質量分數為500 mg·kg-1時，土壤呼吸抑制作用才會發生，主要是由于土壤微生物經過一段時間馴化后，已經適應此種環境。與其相反，Boleas等（2005）實驗結果表明：培養28 d后，氧四環素對土壤呼吸作用仍然具有抑制效應，在1000 mg·kg-1質量分數下抑制率達到40%，這可能是由于土壤條件的改變，吸附的氧四環素重新釋放出來。Vaclavik等（2004）發現氧四環素質量分數在10 mg·kg-1時，對呼吸作用的抑制率達到40%；而在質量分數為1 mg·kg-1時，只有輕微的抑制作用，其抑制作用強度明顯高于本實驗所得結果。另有研究表明，氧四環素在2 d后對土壤呼吸產生明顯的抑制作用，其IC50分別為19.1 mg·kg-1（Thiele-Bruhn和Beck, 2005）。

總的來說，氧四環素在加藥初期對土壤呼吸作用有輕微的抑制作用，明顯低于磺胺嘧啶的抑制程度。這主要是由于氧四環素具有較強吸附特性，使其生物有效性降低。在培養中期，氧四環素對土壤呼吸呈現一定的激活作用，但隨著時間的推移其激活作用也逐漸減弱，這主要是由于土壤微生物逐漸適應添加氧四環素的土壤環境，將其作為碳源或能源。

2.3 諾氟沙星對土壤呼吸強度的影響

諾氟沙星對土壤呼吸強度的影響結果見表1。由表1可以看出，土壤A中在0～2 d內，與對照比較不同濃度諾氟沙星處理土壤的呼吸強度均出現一定的激活作用，尤其是1 mg·kg-1的土壤，其激活率達到15.4%。在2～4 d內土壤呼吸強度的激活作用減弱，僅100 mg·kg-1土壤出現顯著激活效應； 5和10 mg·kg-1土壤呼吸強度出現顯著的抑制效應，抑制率達到14.0%和11.3%；而1、50和200 mg·kg-1的土壤呼吸強度與對照相比并未出現顯著性差異。在4～8 d各處理土壤的呼吸強度均出現一定的抑制作用，最高抑制率達到21.9%。在隨后的培養時間里，各處理土壤呼吸強度的抑制作用逐漸解除，處理土壤與對照相比呼吸強度未出現顯著差異。

在土壤B中0～2 d內，各處理土壤呼吸強度均表現出一定的激活作用，并且隨著濃度的提高，激活強度也增強，最高激活率達25.8%。在2～4 d激活作用消失，進而出現一定的抑制作用；并且高濃度下抑制作用更強。如當質量分數為50 mg·kg-1時，諾氟沙星對土壤呼吸強度的抑制率達到55.4%。在4～8 d內1和5 mg·kg-1土壤呼吸抑制作用解除，但是其他高濃度處理的土壤的呼吸強度仍受到一定程度的抑制。在隨后的培養時間里，土壤呼吸強度與對照相比，均出現微弱的抑制作用。

諾氟沙星對土壤呼吸產生作用的特點明顯與前2種抗生素不同，在加藥初期出現反常的激活作用，這可能是由于諾氟沙星對土壤微生物具有一定的刺激作用。而后期則出現一定的抑制作用，可能因為其代謝產物對土壤微生物具有一定的抑制作用。但隨著時間的推移，其抑制作用也逐漸解除，這可能由于諾氟沙星本身的消減及吸附作用最終使其生物有效性降低，進而減輕了對土壤微生物的毒害作用。

圖1 磺胺嘧啶對土壤硝化作用的影響Fig.1 The effects of sulfadiazine on soil nitrification activities

圖2 氧四環素對土壤硝化作用的影響Fig.2 The effect of oxytetracycline on soil nitrification activities

2.4 抗生素對土壤硝化作用影響

3種不同抗生素對土壤硝化作用，結果見圖1～圖3。由圖1可以看出，在土壤A中培養21 d后，不同濃度磺胺嘧啶處理的土壤中硝態氮的含量與對照處理相比，有略微降低。通過Duncan檢驗得出，不同處理與對照相比不存在顯著差異（P=0.05水平），并且不同處理之間也同樣不存在顯著性差異。說明在土壤A中磺胺嘧啶的輸入對土壤的硝化作用基本不影響。在土壤B中不同處理土壤中硝態氮的含量與對照相比均有一定程度的下降，并且隨著磺胺嘧啶質量分數的增加，硝態氮的含量出現下降的趨勢（除5 mg·kg-1土壤外）。通過Duncan檢驗（P=0.05），5、50、100和200 mg·kg-1的土壤與對照處理之間存在顯著性差異，但它們相互之間不存在顯著性差異；1和10 mg·kg-1的土壤與對照相比也不存在顯著差異。當添加質量分數為200 mg·kg-1時，抑制率為20%，此結果與其他研究結果類似。Kotzerke等（2008）研究發現：低質量分數磺胺嘧啶（10 mg·kg-1）處理土壤與對照相比，氮硝化速率未出現明顯變化；僅高質量分數（100 mg·kg-1）的磺胺嘧啶導致氮硝化速率的顯著下降。從土壤微生物群落水平、酶水平或是基因水平，磺胺嘧啶對土壤中的氮硝化過程均顯示出一定的影響。

由圖2可以看出，在土壤A中氧四環素處理的土壤與對照相比，硝態氮的含量在低質量分數下（1、5、10和50 mg·kg-1）不存在顯著性差性。但在高質量分數下（100和200 mg·kg-1）卻存在顯著性差異，并且濃度越高，差異越顯著，說明在高質量分數下氧四環素對土壤硝化作用產生一定影響，最大抑制率為47%。而在土壤B中不同濃度氧四環素處理的土壤與對照相比，硝態氮的含量有略微的提高。通過Duncan檢驗（P=0.05）各種不同處理與對照之間均不存在顯著性差異。關于氧四環素對氮硝化作用的影響研究結果呈現一定差異。如在活性污泥中，氧四環素（0～250 mg·L-1）對生物量和氮硝化過程均沒有明顯影響（Gomez等，1996）；Campos等（2001）研究發現氧四環素在10 mg·L-1時引起生物膜脫落，但在100 mg·L-1時，氮硝化過程都未受影響；當質量濃度從100 mg·L-1提高到250 mg·L-1時，氮硝化速率的抑制率為50%。

諾氟沙星對土壤硝化作用的影響見圖3。由圖3可以看出，在土壤A中1 mg·kg-1土壤中硝態氮的含量略高于空白對照，二者之間存在顯著性差異；說明諾氟沙星在低濃度下對氮硝化作用具有一定激活作用，激活率為9%，而5、10、50和100 mg·kg-1土壤中硝態氮含量則與對照相差不大，不存在顯著性差異。在200 mg·kg-1土壤中，土壤硝態氮的含量明顯低于空白對照，二者之間存在顯著性差異。研究結果表明在高濃度下，諾氟沙星對土壤A中微生物的硝化作用具有抑制作用，最大抑制率為19%。在土壤B中不同處理之間，土壤中硝態氮的含量變化不大，不存在顯著性差異。

土壤的硝化作用受很多因素影響，如土壤酸度、通氣狀況、溫度和濕度、氨氮含量等。由于硝化反應本身是個產酸反應，pH值對其過程影響較大。在本研究中，2種土壤中pH值差別較大（4.30和6.67），因此它們的硝化過程區別可能較大。磺胺嘧啶對土壤A的硝化作用沒有影響，而對土壤B硝化作用卻有影響；氧四環素和諾氟沙星則相反，對土壤A的硝化作用有影響，但對土壤B卻無影響。此種差別可能是由于土壤pH值和抗生素本身的抗菌譜所引起。一般認為隨著抗菌譜的擴大，抗生素對氮硝化作用的影響也越大（Halling-Sφrensen，2001)。

圖3 諾氟沙星對土壤硝化作用的影響Fig.3 The effect of norfloxacin on soil nitrification activities

3 討論

土壤環境中的抗生素的抗菌作用受很多因素影響，如本身的理化特性、氣候條件、土壤類型以及其他環境條件。因此，抗生素對土壤微生物的影響需從不同角度進行闡述。

首先，磺胺嘧啶、氧四環素和諾氟沙星的抗菌機理完全不同。磺胺嘧啶通過抑制葉酸的合成而抑制細菌的繁殖；氧四環素可通過與核蛋白體的30S亞單位結合，從而阻止氨酰基tRNA同核蛋白體結合；諾氟沙星通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復制而導致細菌死亡。3種抗生素的不同抗菌機制可能是它們對土壤呼吸作用和氮硝化作用影響呈現出不同特點的一個重要因素。

其次，抗生素的理化性質。由于抗生素在土壤中的物理化學行為主要受其本身的化學結構所決定。一般來講，抗生素分子結構、大小、形態、水溶性和親水性不同，其在土壤中的吸附行為也將完全不同。實驗中3種抗生素在土壤中的吸附強弱相差較大，氧四環素的分配系數為1026 L·kg-1(Rabφlle和SPLIID，2006)，磺胺嘧啶為2.0 L·kg-1(Thiele-Bruhn等, 2004)，而諾氟沙星則高于1100 L·kg-1(張勁強和董元華，2007)。在實驗初期，磺胺嘧啶能夠強烈抑制土壤呼吸作用，而氧四環素和諾氟沙星則對土壤呼吸作用較弱，甚至出現刺激作用。這可能是由于氧四環素和諾氟沙星施用土壤后，強烈吸附于土壤上，從而導致其抗菌作用效果下降。Zielezny等（2006）研究發現：磺胺嘧啶在1 mg·kg-1時就能夠改變土壤微生物組成；相反，氯四環素在50 mg·kg-1對土壤呼吸作用都未發生影響。當然，吸附作用雖然影響抗生素的抗菌作用，但并不意味著抗菌活性完全喪失（Sengelφv等, 2003）。例如，被黏土緊密吸附的四環素和泰樂素仍然保持一定的活性，對環境中的耐藥菌具有一定的選擇性（Chander等, 2005）。

最后，土壤類型在一定程度影響著抗生素的抗菌作用，這其中包括微生物種類和數量、土壤的理化性質等。在本研究中，3種抗生素在2種不同土壤中對土壤呼吸和氮硝化作用影響不盡相同。而這2種土壤最顯著的區別在于土壤的pH不同，分別為4.30（土壤A）和6.67（土壤B）。這3種抗生素都具2個或以上的解離常數，在不同pH的土壤中它們會以不同離子形態存在，這些不同形態抗生素的抗菌效果以及在土壤中的行為則發生一定的改變，最終導致本實驗結果的不同。

4 結論

1）從總體上看，磺胺嘧啶和氧四環素在初始階段對土壤呼吸作用具有一定的抑制作用，而在后期則具有一定刺激作用，但氧四環素的抑制作用明顯低于磺胺嘧啶；諾氟沙星對土壤呼吸作用的特點明顯與前2種抗生素不同，在加藥初期出現激活作用。

2）磺胺嘧啶對土壤A的硝化作用沒有影響，而對土壤B硝化作用卻有影響；氧四環素和諾氟沙星則相反，對土壤A的硝化作用有影響，但對土壤B卻無影響。

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Effects of three types of antibiotics on soil respiration and nitrification

YANG Jifeng1,2,3, YING Guangguo1*, LAI Huajie1, ZHAO Jianliang1, LIU Shan1, ZHOU Lijun1
1. Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China；2. Chemistry and Chemical Engineering College, Hunan University of Arts and Science, Changde 41500, China；3. Chemistry and Chemical Engineering College, Hunan University, Changsha 410082, China

Antibiotics are widely administrated in human and livestock to treat diseases and most of them were excreted as mother molecules. Subsequently, antibiotic residues can enter into environment through the route of biosolid application in field, wastewater irrigation and others, which might pose a potential threaten to terrestrial eco-environment. For assessing the role of different types of antibiotics in influencing soil microbial activity and function, this paper investigated the effects of antibiotics on soil respiration and nitrification using sulfadiazine, oxytetracycline and norfloxacin as target chemicals and OECD standard method. In the respiration experiments, both sulfadiazine and oxytetracycline inhibited soil microbial respiration at the early stage of experiments, but the inhibiting rate for sulfadiazine was stronger than oxtetracycline. The highest inhibiting rates for sulfadiazine and oxytetracycline were 76.8% and 20.7%. The stimulation effects of sulfadiazine and oxytetracycline were found at the later stage of soil respiration experiments and the highest activating rates were 343% and 218%, respectively. However, the stimulation effects became weaker as time elapse. At the early stage of experiment, norfloxacin stimulated the micriobial respiration with the highest rate of 15.4% and the highest inhibiting rate of 21.9% was found at the later stage of experiment. In the nitrification experiments, sulfadiazine inhibited microbial nitrification for soil B a, not for soil A. The strongest inhibition rate was 20% for sulfadiazine in soil B. On the contrary, the inhibition effect of nitrification was found for oxytetracycline and norfloxacin in soil A and the inhibiting rates were 50% and 19%, respectively. The difference in effects of antibiotics on nitrification is contributed to soil pH and antibacterial spectrum of antibiotics. In conclusion, the results of soil microbial activity and nitro-transformation function is different for three types of antibiotics, which rise from antibiotics types, soil types and antibiotics concentration. Therefore, the risk should be assessed when antibiotics enter into terrestrial environment as manure form.

antibiotics; soil; respiration; nitrification

X131.3

A

1674-5906（2014）06-1050-07

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國家自然科學基金項目（U1133005）；有機地球化學國家重點實驗室開放基金（OGL-201206）；湖南省自然科學基金（13JJ3155）

楊基峰（1977年生），男，副教授，主要研究環境化學與生態毒理學。E-mail:clark_yang@yeah.net

*通信作者，E-mail: guang-guo.ying@gig.ac.cn

2014-04-01