美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護作用

陸 麗，張旭強，甘 平，何 旭，陳俊雅，彭 芳*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護作用

陸 麗1，張旭強2，甘 平2，何 旭2，陳俊雅2，彭 芳2*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物（CⅡ-3）對ISO所致大鼠心肌缺血的保護作用。方法：采用皮下注射ISO誘發大鼠心肌缺血。觀察心肌缺血大鼠ECG的S-T段、Q-T間期的變化，血清中LDH、SOD、CK和MDA含量及心肌病理損傷情況。結果：3個劑量組的CⅡ-3都能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），中、高劑量組能顯著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的活性（P＜0.05），高劑量組能降低CK的活性（P＜0.05），但3個劑量組對LDH活性影響較小（P＞0.05）。病理檢測顯示3個劑量組的CⅡ-3能不同程度的減輕大鼠心肌病理組織的損傷程度。結論：CⅡ-3對ISO誘導的大鼠心肌缺血具有一定的保護作用。

美洲大蠊；心肌缺血；異丙腎上腺素

美洲大蠊（Periplaneta americana）屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂、偷油婆等。近年來學者們對美洲大蠊進行了系列的研究，并取得一定的成果。已有學者研究表明，從美洲大蠊中提取制備的心脈隆注射液具有強心、增加心輸出量及改善微循環等作用〔1-2〕，提示美洲大蠊中具有較好的心血管活性物質。本實驗旨在探討美洲大蠊另一個有效部位CⅡ-3對異丙腎上腺素（Isoprenaline，ISO）誘發大鼠心肌缺血是否有保護作用，為開發美洲大蠊系列藥物提供一定的依據。

1 實驗材料

1.1動物SD大鼠，雌雄各半，體重180～200 g，由中國人民解放軍第三軍醫大學提供，合格證號：SCXK（渝）2007003。

1.2儀器1.0型高速低溫離心機（德國Heraeus）；JH-C-06-04型紫外分光光度計（上海青華科技儀器有限公司）；HS21-4型數顯恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；BL-420E+生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.3試劑與藥品超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號：20100816）；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒（批號：20100720）；肌酸激酶（CK）測試盒（批號：20100723）；丙 二 醛（MDA）測試 盒（批 號：20100819），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。ISO（上海禾豐制藥有限公司，生產批號：100203）；復方丹參片（北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠；生產批號：100128）；普萘洛爾（汕頭金石制藥總廠；批號：100302）。CⅡ-3由大理學院劉光明教授提供。CⅡ-3是從美洲大蠊中經特定工藝提取所得，提取物占生藥的比率為0.2%。

2 實驗方法

2.1實驗動物分組與模型的建立取雌雄各半的SD大鼠，25%烏拉坦腹腔注射麻醉（1 g∕kg），背位固定。記錄給藥前大鼠正常ECG（心電圖），棄去S-T段、T波有異常改變和心律失常的大鼠。將篩選后的70只大鼠，隨機分為7組，即正常對照組，陰性對照組，陽性對照組（復方丹參片320 mg∕kg；普萘洛爾20 mg∕kg），CⅡ-3高、中、低劑量組（100 mg∕kg；50 mg∕kg；25 mg∕kg），每組10只。各組動物分別灌胃給藥，1次∕d，連續7 d，第5天灌胃給藥40 min后，除正常對照組外皮下多點注射ISO（5 mg∕kg）（皮下多點注射部位包括：四肢根部和背部共5～6點，10 s內注射完畢），連續3 d。正常對照組皮下注射等體積的生理鹽水。最后一次注射ISO后，測以下各指標。2.2 ECG記錄采用BL-420E+生物機能實驗系統軟件記錄大鼠Ⅱ導聯ECG 10 min。與缺血前ECG相比，以QRS復合波起點的連線作等電線觀察S-T段的偏移，每次取5個心動周期的S-T段偏移值（△ST）和Q-T間期變化值（△QT），以其均數作為觀測指標。以陰性對照組ST段向上或向下偏移＞0.1 mv為造模成功標準。

2.3 CK、LDH、SOD的活性以及MDA含量檢測最后一次注射ISO 6 h后，各組大鼠眼球取血，4℃低溫離心（3 500 r∕min），15 min，取血清，按測試盒說明測定CK、LDH、SOD和MDA的含量。

2.4組織病理檢測取血后處死大鼠，立即取出心臟，用銳利刀片取左室與心尖部中點左心室前壁小塊心肌（體積為2 mm×2 mm×2 mm），固定、脫水、包埋、切片、HE染色后在光學顯微鏡下觀察大鼠心肌病理組織。

3 統計學處理

4 實驗結果

陰性對照組△ST＞0.1 mv，且與正常對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05），說明實驗造模成功。與陰性對照組比較，CⅡ-3的3個劑量組都能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），但無劑量依賴性；與普萘洛爾組比較，CⅡ-3中劑量的作用與普萘洛爾比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與復方丹參片組比較，CⅡ-3中、高劑量的作用與復方丹參片比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影響（，n=10）

表1 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影響（，n=10）

注：與正常對照組比較#P＜0.05；與陰性對照組比較*P＜0.05；與普萘洛爾組比較△P＜0.05；與復方丹參片組比較&P＜0.05。

△ST∕mv 0.02±0.01*△&0.42±0.11#△&0.08±0.03*&0.17±0.02#△*0.29±0.04#△&*0.13±0.08#*0.15±0.09#*△組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0△QT∕ms 1.01±0.52*&12.24±2.89#△&3.80±1.02*4.99±3.54#*9.75±3.97#△&*6.80±2.54#*7.50±3.10#*△

與正常對照組比較，陰性對照組的MDA含量顯著高于正常對照組（P＜0.01）；陰性對照組SOD含量顯著低于正常對照組（P＜0.01）。與模型對照組比較，CⅡ-3中、高劑量組與陽性對照組一樣能顯著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的含量（P＜0.05）。見表2。

表2 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠SOD、MDA的影響（，n=10）

表2 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠SOD、MDA的影響（，n=10）

注：與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

SOD∕(U∕mL) 251.88±13.43**192.73±12.83##231.18±28.64*226.61±27.83*#207.38±37.85#220.28±23.05#*221.85±21.88*#組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 MDA∕(nmoL∕mL) 4.24±1.92**8.48±1.99##4.57±0.84**4.40±1.05**5.38±1.22*4.92±1.68**5.08±2.06**

陰性對照組的LDH活性、CK活性顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，CⅡ-3高劑量與陽性對照組一樣能降低血清中CK的活性（P＜0.05），CⅡ-3的3個劑量略能降低LDH活性，但差異無統計學意義。見表3。

表3 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影響（，n=10）

表3 CⅡ-3對ISO誘導心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影響（，n=10）

注：與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

LDH∕(U∕mL) 2.68±0.74**4.19±0.59##3.39±0.65*#3.19±0.58*#3.62±0.68#3.69±0.75#3.55±0.66#組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 CK∕(U∕mL) 1.12±0.18**1.62±0.31##1.34±0.29*#1.37±0.22*#1.52±0.25#1.41±0.36#1.38±0.35*#

在光學顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠心肌組織未見病理形態學改變。陰性對照組可見心肌纖維明顯萎縮、斷裂，心肌間炎癥細胞浸潤明顯，部分心肌纖維胞漿濃縮呈凝固性壞死，部分呈溶解性壞死；陽性對照組心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，僅見個別或極少量炎癥細胞浸潤和少量心肌纖維萎縮。CⅡ-3低劑量組的心肌組織損傷較陰性對照組有所減輕，但仍可見部分心肌纖維萎縮、斷裂，心肌間質炎癥細胞浸潤較明顯；CⅡ-3中、高劑量組心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，只見少量炎癥細胞浸潤和少量心肌纖維萎縮和斷裂，間質間隙變寬。見圖1。

圖1 心肌缺血大鼠心室病理切片圖（HE，×100）

5 討論

ISO屬于人工合成的兒茶酚胺類β腎上腺素受體激動藥，大劑量的ISO可激活心肌細胞β1受體，使心臟過度興奮，心肌耗氧量增加；同時激活β2受體，使冠狀動脈擴張，冠脈壓力下降，從而導致心肌缺血、缺氧，進而引起心肌細胞損傷，造成心肌細胞膜內外離子成分及其濃度改變，從而影響心肌細胞的極化狀態和除極、復極程序，反映在ECG上表現為心電圖的改變〔3〕。ISO所誘導的大鼠心肌缺血損傷模型的缺血損傷的漸進性及心肌酶學變化均類似于人類急性心肌梗死的病變特征，所以此模型是評價心肌保護藥常用的心肌缺血損傷模型之一，已有30余年的歷史，該模型簡便、穩定，便于觀察急性心肌缺血大鼠的ECG變化〔4〕。

心肌缺血ECG的改變其病理學基礎是心肌的血液供應障礙，由于心肌血液微循環障礙的程度不同，ECG分別表現為S-T段呈弓背型抬高、T波倒置，病理性Q波。實驗結果顯示，與陰性對照組比較CⅡ-3（25，50，100 mg∕kg）能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），提示CⅡ-3具有防治或減輕心肌損傷，改善缺血缺氧狀態，保護心肌細胞的作用。

當心肌細胞缺血受損，細胞膜通透性增加，細胞內LDH和CK外漏致血中LDH和CK升高，所以血清中LDH、CK活性可以間接反映心肌損傷程度變化。特別是CK在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發生時，血清中CK水平迅速提高。心肌梗死時，CK在發病6 h內升高，24 h達高峰，3～4日內恢復正常，因此CK的變化是臨床診斷患者患有心肌缺血性損傷的重要參考指標〔5〕。實驗結果顯示，CⅡ-3（100 mg∕kg）與普萘洛爾、復方丹參片一樣能降低血清中CK的活性（P＜0.05），說明一定濃度的CⅡ-3可以穩定心肌細胞膜，對心肌缺血損傷有一定的保護作用。試驗中還發現3個劑量的CⅡ-3略能降低血清中LDH活性，但差異沒有統計學意義，其原因可能是LDH廣泛分布在心肌、骨骼肌和肝臟中，當ISO導致大鼠心肌缺血的同時也損傷了其它組織器官，進而使大鼠血清中LDH的活性大大增強，而一定量的CⅡ-3不能完全抵抗LDH的這種活性。

心肌缺血時心肌病理形態學發生改變，可見心肌間炎癥細胞浸潤明顯，心肌纖維胞漿濃縮呈凝固性或溶解性壞死。實驗結果顯示：CⅡ-3組大鼠的心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，只見少量炎癥細胞浸潤和心肌纖維萎縮、斷裂。說明CⅡ-3可以改善心肌病理損傷程度。

心肌缺血時產生大量的氧自由基，氧自由基是一類具有高度化學反應活性的含氧基團，是機體內氧分子的不完全代謝產物。它可聚集在體表、心臟、血管、肝臟和腦細胞中，它能與各種細胞成分發生反應，造成細胞膜的損傷或細胞的死亡。如果沉積在血管壁上，會使血管發生纖維性病變，導致動脈管硬化、高血壓、心肌梗塞等，是造成人類衰老和疾病的元兇。SOD是需氧生物體內的一種含金屬離子的酶蛋白，它是機體清除氧自由基的重要酶類，它的活性的高低間接地反映了機體清除自由基的能力。當心肌受損時，SOD活性降低，含雙鍵的脂肪酸過氧化生成MDA，MDA可使膜成分之間發生交聯和聚合，從而使膜的變構、離子傳遞、酶活性等發生改變〔6-11〕。因此MDA的含量高低可間接反映心肌細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度。實驗結果發現：CⅡ-3（50，100 mg∕kg）與普萘洛爾、復方丹參片一樣能顯著降低血清中MDA的含量和提高血清中SOD的活性，說明CⅡ-3可以提高機體清除氧自由基的能力，抑制脂質過氧化過程，減少脂質過氧化物對心肌的損傷。

本實驗表明，CⅡ-3對ISO誘導的心肌缺血大鼠具有一定的保護作用，其具體的作用機制還有待進一步研究。

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*通信作者：彭芳，教授.

（責任編輯 李 楊）

Protective Effect of Periplaneta americana Extracts on Myocardial Ischemia Induced by Isoproterenol in Rats

LU Li1,ZHANG Xuqiang2,GAN Ping2,HE Xu2,CHEN Junya2,PENG Fang2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the protective effect of CⅡ-3 extracted from Periplaneta americana on myocardial ischemia in rats induced by isoproterenol(ISO).Methods:The myocardial ischemia model was made by using subcutaneous injection of ISO in rats. The change of S-T segment and Q-T interval of electrocardiogram(ECG)was observed,and the content of LDH,CK,SOD and MDA in serum was measured.The pathological lesion of myocardium were observed.Results:Three types of dosage of CⅡ-3（low,25 mg∕kg; mid,50 mg∕kg;high,100 mg∕kg）all significantly reduced S-T segment deviation and shortened Q-T interval(P＜0.05).Middle and high dosage of CⅡ-3 significantly reduced the content of MDA(P＜0.01)and raised the activity of SOD(P＜0.05).High dosage of CⅡ-3 reduced the activity of CK(P＜0.05),but three dosage of CⅡ-3 had the subtle effect on the activity of LDH. Pathological examination showed that three dosages of CⅡ-3 could reduce the pathological lesion of myocardium in rats to varying degrees.Conclusion:CⅡ-3 had some protective effect on myocardial ischemia in rats induced by ISO.

Periplaneta americana;myocardial ischemia;isoproterenol

R285.5

A

1672-2345（2014）08-0007-04

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.003

2014-04-04

2014-05-12

陸麗，助理實驗師，主要從事機能學教學研究.