Bax/Bcl-2、IFABP及D-D在大鼠急性腸系膜上靜脈血栓形成后表達及意義

趙得銀，劉 斌，曹志新，謝文濤，司小毛，方鯤鵬

Bax/Bcl-2、IFABP及D-D在大鼠急性腸系膜上靜脈血栓形成后表達及意義

趙得銀1，2，劉 斌1，曹志新1，謝文濤1，司小毛1，方鯤鵬1

目的研究大鼠急性腸系膜上靜脈血栓形成（ASMVT）后受累小腸在不同時間點的病理學改變及其細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達和相應時點血清腸脂肪酸結合蛋白（IFABP）及D-二聚體（D-D）作為ASMVT后小腸病理改變及病情監測指標。方法72只成年雄性大鼠隨機分為對照組、假手術組、實驗組。于建模后30 min，1、2、4h取病變腸段觀察病理改變、檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，同時測血清IFABP、D-D值。結果與對照組和假手術組比較，在各個時間點實驗組大鼠檢測腸Bcl-2和Bax表達均顯著增加（P＜0.05）；Bax/Bcl-2顯著升高（P＜0.05）；與對照組和假手術組比較，在各個時間點實驗組大鼠血清IFABP和D-D濃度均顯著升高（P＜0.05），且隨時間延長增加顯著。結論ASMVT后受累小腸在不同時間點的病理學改變及Bax/Bcl-2的表達，結合相應時點血清IFABP及D-D，可以診斷和監測ASMVT的病情。

Bcl-2；Bax；腸脂肪酸結合蛋白；D-二聚體；急性腸系膜上靜脈血栓形成

急性腸系膜上靜脈血栓形成（acute superior mesenteric venous thrombosis，ASMVT）是一種少見的急腹癥，占整個腸缺血性疾病的6%～9%［1］。其病因復雜，臨床表現缺乏特異性，早期診斷難，易被誤診和漏診；目前臨床上缺乏快速而準確的診斷及病情判斷指標。該研究試圖通過分析大鼠ASMVT后受累小腸在不同時間點的病理學改變及其細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達，結合檢測相應時點血清腸脂肪酸結合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，IFABP）及D-二聚體（D-dimer，D-D）濃度，探討ASMVT后不同時間小腸病理改變及監測指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級SD雄性大鼠72只，體重365～450（405±18）g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥品、試劑與儀器IFABP酶聯反應試劑盒、Bcl-2、Bax一抗、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型制備 72只SD大鼠隨機分成對照組、假手術組、實驗組，每組24只。各組內再隨機分成建模后30 min組、建模后1h組、建模后2h組、建模后4h組，每組6只。所有大鼠術前禁食12h，不禁水，稱重后10%水合氯醛（0.3 ml/100 mg）腹腔注射麻醉。備皮后固定于手術臺，術野75%乙醇溶液消毒，腹部正中線開腹。對照組，僅在各相應時間點采血及切取腸組織。假手術組，僅麻醉后開腹顯露腸系膜上靜脈主干。實驗組，采取扎閉腸系膜上靜脈主干方法建立急性腸系膜上靜脈血栓的模型［2－3］。各組大鼠于相應時間點采集血液樣本及切取病變腸段的腸管，對照組及假手術組切取與實驗組大鼠相應的腸段。

1.3.2 血清IFABP及D-D測定 分別于實驗組建模后30 min，1、2、4h各個時間點對各組大鼠抽取血液樣本，所有血樣本用離心機離心10 min（3 000 r/min）取上清液。D-D檢測立即送檢，應用全自動凝血分析儀測定。血清IFABP樣本于離心后取血清－80℃保存，1周內檢測。

1.3.3 病理形態學觀察 各組所有大鼠采集血樣本后立即切取病變腸段（回腸段約5 cm），清洗腸腔后10%福爾馬林固定（對照組和假手術組取與實驗組病變腸段相應的腸段）。脫水后石蠟包埋，切片厚度為3 μm。常規HE染色后，在40倍顯微鏡下觀察回腸病理形態學改變。

1.3.4 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax表達 采用鏈酶親和素－生物素－復合物法（SABC三步法）檢測，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。用已知陽性標本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性反應為細胞質呈棕褐色。各時間點從每組隨意選取6張切片，每張切片在高倍顯微鏡下任意選擇3個視野進行圖像分析。圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0分析測量圖像軟件，分別測定Bcl-2和Bax的平均吸光度值，以平均吸光度作為Bax、Bcl-2基因蛋白表達水平的半定量參數。

1.4 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 腸管切片常規HE染色觀察對照組大鼠腸壁全層細胞形態正常，結構清楚。假手術組部分大鼠腸黏膜上皮細胞輕度水腫，無明顯黏膜脫落，實驗組大鼠建模后30 min即可見腸黏膜層淤血，腺體擴張，少量黏膜破壞、脫落，腸系膜靜脈淤血擴張，未見明顯血栓。建模后1h可見腸絨毛排列紊亂，部分脫落，腺體擴張，絨毛及腺體周圍少量出血，系膜血管內仍未見明顯血栓形成。建模后2h，腸黏膜上皮破壞進一步加重，脫落明顯，絨毛及腺體周圍出血增加，少部分大鼠小腸系膜血管內可見血栓形成。建模后4h，大鼠腸管擴張變薄，腸黏膜上皮脫落明顯，正常絨毛結構少見，腺體破壞、減少，黏膜層及黏膜下層亦可見明顯出血，部分肌層壞死明顯，甚至全層壞死，系膜血管內可見血栓形成。

2.2 免疫組化法檢測Bax、Bcl-2的表達情況在各個時間點，與對照組及假手術組比較，實驗組大鼠腸管Bax、Bcl-2表達均明顯升高（P＜0.05），假手術組則較對照組略有升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1、圖1。

表1 對照組、假手術組、實驗組大鼠腸Bcl-2、Bax表達情況比較（n＝24，±s）

表1 對照組、假手術組、實驗組大鼠腸Bcl-2、Bax表達情況比較（n＝24，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與假手術組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后1h BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后2h BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后4h BaxBcl-2Bax/Bcl-2對照0.075±0.0070.198±0.0330.3790.085±0.0110.175±0.0430.4860.080±0.0100.184±0.0350.4350.077±0.0110.192±0.0350.401假手術0.084±0.0090.196±0.0300.4290.087±0.0120.203±0.0310.4290.085±0.0120.207±0.0260.4110.086±0.0150.195±0.0280.441實驗0.285±0.038*＃0.473±0.062*＃0.603*＃0.331±0.039*＃0.451±0.066*＃0.734*＃0.389±0.060*＃0.396±0.064*＃0.982*＃0.218±0.050*＃0.248±0.048*＃0.879*＃

圖1 實驗組大鼠各個時間點回腸Bax、Bcl-2蛋白表達情況 DAB×400

2.3 血清IFABP檢測對建模后30 min，1、2、4h 4個時間點對照組、假手術組和實驗組組間分別比較，實驗組大鼠血清IFABP較對照組和假手術組均顯著增加（P＜0.05），假手術組較對照組略有變化，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清IFABP值比較（n＝24，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠血清IFABP值比較（n＝24，pg/ml，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與假手術組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min建模后1h建模后2h建模后4h對照29.59±5.2529.23±4.6127.71±4.7528.33±4.41假手術31.74±5.4833.49±5.6430.10±6.0332.81±6.47實驗130.73±11.97*＃296.14±31.68*＃378.33±35.99*＃523.35±32.73*＃

2.4 血清D-D檢測對建模后30 min，1、2、4h 4個時間點對照組、假手術組和實驗組組間分別比較，實驗組大鼠血清D-D較對照組和假手術組均顯著增加（P＜0.05），假手術組較對照組略有變化，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清D-D值比較（n＝24，mg/L，±s）

表3 各組大鼠血清D-D值比較（n＝24，mg/L，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與假手術組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min建模后1h建模后2h建模后4h對照0.30±0.090.35±0.100.33±0.100.32±0.12假手術0.33±0.120.35±0.100.37±0.120.40±0.13實驗1.07±0.31*＃1.12±0.32*＃1.31±0.31*＃1.67±0.26*＃

3 討論

ASMVT后腸道會發生淤血及缺血性改變［2，4］，缺血可導致腸黏膜水腫、充血，進一步發展可出現黏膜出血、壞死及脫落，嚴重情況下可出現腸壁壞死、腸腔出血，整個過程都有細胞凋亡參與。通過檢測大鼠ASMVT后腸組織細胞凋亡相關蛋白，可以反映大鼠腸管缺血情況。Bcl-2/Bax的比值決定著細胞在受到凋亡刺激后的生存與凋亡［5－6］。Bcl-2蛋白表達下調，Bax蛋白過量表達，Bcl-2/Bax下降則促進細胞凋亡，否則反之。本研究顯示Bax、Bcl-2在對照組大鼠腸管組織呈低表達，假手術組較對照組表達變化不明顯；實驗組大鼠在結扎腸系膜上靜脈后30 min，1、2h，Bax、Bcl-2表達較對照組及假手術組明顯升高，Bcl-2隨著時間延長表達呈下降趨勢，Bax/Bcl-2比值則明顯升高，說明大鼠腸上皮細胞向著凋亡方向發展。建模后4h，Bax、Bcl-2表達均較之前明顯下降，分析原因可能為腸系膜上靜脈結扎后4h大鼠腸管明顯壞死，黏膜脫落，腺體變少，肌層出血壞死，腸管擴張變薄有關，因此雖然實際細胞凋亡增加，但免疫組化檢測值下降。

IFABP在正常人群的血液和尿液中難于檢出，而小腸缺血早期患者的血清和尿液中IFABP升高，特別是腸系膜梗死患者升高更為顯著。Kanda et al［7］研究認為幾乎所有急腹癥患者都會出現IFABP升高，但是小腸缺血性疾病明顯高于非缺血性疾病。本研究中在各個相應時間點實驗組大鼠血清IFABP濃度比對照組和假手術組均明顯升高，且隨時間延長持續增加。說明大鼠腸淤血及缺血后IFABP釋放增加且病變程度越重，其在血清中濃度越高。提示IFABP在ASMVT疾病時，早期血清即有明顯變化，且檢測值越高提示病變嚴重程度越高。

D-D是纖維蛋白降解后一種特異性終產物，可以反映體內凝血和纖溶的變化過程，對血栓性疾病的診斷有重要意義［8］。其異常增高與血栓疾病，如肺栓塞、深靜脈血栓形成、彌漫性血管內凝血等關系已有較多的研究，臨床上常用于靜脈血栓的排除性診斷。Altinyollar et al［9］進行動物研究提示血漿DD可作為早期診斷急性腸系膜缺血的標志物。有研究［10］顯示腸系膜靜脈血栓性疾病者血漿D-D均明顯高于正常值。本研究進一步證實對照組大鼠D-D值均處于低水平，假手術組大鼠D-D值隨開腹時間延長略有升高，但差異無統計學意義。實驗組D-D隨時間延長有明顯升高，且隨時間延長濃度持續升高。因此，本研究提示D-D值變化能反映大鼠體內血栓形成及嚴重程度、發展變化趨勢。

綜上所述，本研究通過結扎法建立大鼠ASMVT模型，研究受累腸管細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達，結合相應時間點血清IFABP、D-D指標，對ASMVT的及早診斷及受累腸管的病理改變程度的判斷有一定的臨床借鑒意義。

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The expression and significance of Bax/Bcl-2，IFABP and D-dimer after acute superior mesenteric venous thrombosis in rats

Zhao Deyin1，2，Liu Bin1，Cao Zhixin1，et al
（1Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of General Surgery，The Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 234000）

ObjectiveTo study the significance of pathological changes and expression of apoptosis-related proteins Bax/Bcl-2，combined with the values of serum intestinal fatty acid binding protein（IFABP）and D-dimer（D-D）in different time after acute superior mesenteric venous thrombosis（ASMVT）in rats.Methods72 SD adult male rats were randomly divided into control group，sham-operation group and model group.The small intestine was cut partly to observe pathological changes and detect the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax after modeling for 30 minutes，1，2，4hours，respectively；meanwhile，IFABP and D-D serum values were also detected respectively.ResultsIn model group，the expression of Bcl-2 and Bax was significantly increased（P＜0.05）；Bax/Bcl-2 increased significantly（P＜0.05）；the concentration of serum IFABP and D-D was significantlyhigher（P＜0.05）.ConclusionThe study suggests that pathological changes and the expression of Bax/Bcl-2 in intestinal combined with the serum IFABP and D-D after ASMVT can be used to diagnose and monitor ASMVT.

Bcl-2；Bax；intestinal fatty acid binding protein；D-dimer；acute superior mesenteric venous thrombosis

R 572.3

A

1000－1492（2014）04－0451－04

2013－12－20接收

安徽省教育廳自然科學基金（編號：2006KJ375B）

1安徽醫科大學第一附屬醫院普通外科，合肥 230022

2宿州市立醫院普通外科，宿州 234000

趙得銀，男，主治醫師，碩士研究生；劉 斌，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：anyiliubin＠qq.com