蠶豆根尖微核試驗研究云南松松塔球提取物抑突變性

林 牧，劉光明，蔣錫超，李云靜，馬志敏

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003；3.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；4.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；5.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001）

蠶豆根尖微核試驗研究云南松松塔球提取物抑突變性

林 牧1，劉光明3，蔣錫超4，李云靜5，馬志敏2*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003；3.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；4.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；5.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001）

目的：探討云南松松塔球提取物的抑突變作用。方法：分別將大理鄧川和灣橋產(chǎn)的蠶豆隨機(jī)分為4組，經(jīng)實驗處理后，采用蠶豆根尖微核技術(shù)對蠶豆根尖細(xì)胞微核數(shù)進(jìn)行檢測，考察松塔球提取物對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響情況。結(jié)果：松塔球提取物I對鄧川產(chǎn)蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生有抑制作用，抑制率達(dá)50%，且對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖微核有明顯的抑制作用，抑制率為62.5%。松塔球提取物I對灣橋產(chǎn)蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生有抑制作用，抑制率達(dá)50%，且對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核有明顯的抑制作用，抑制率為50%。結(jié)論：松塔球提取物可有效抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖微核的產(chǎn)生，具有抑突變性，從而說明松塔球提取物對腫瘤的防治可能具有積極的作用。

松塔球提取物；抑突變性；蠶豆根尖微核技術(shù)

隨著腫瘤發(fā)病率的上升，腫瘤的預(yù)防和治療一直是國內(nèi)外專家學(xué)者的重要課題。松塔，又稱松塔球，系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物紅松、馬尾松、華山松、油松等的球果，可入藥，具有很大的開發(fā)潛力〔1〕。現(xiàn)代研究表明，松塔中還含有抑菌消炎、抗病毒及抗腫瘤等作用的化學(xué)成分〔2〕。微核（micro?nuclei，MN）是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的〔3〕。微核的形成與腫瘤的發(fā)生有一定的聯(lián)系。微核是惡變的先兆，在癌細(xì)胞和臨床癥狀之前出現(xiàn)〔4〕。目前，用于檢測外源物質(zhì)致突變效應(yīng)的方法較多，本文利用蠶豆根尖細(xì)胞對致癌物和抗癌物都很敏感的特性，使用蠶豆微核試驗來探討松塔球提取物對環(huán)磷酰胺誘發(fā)微核的影響，進(jìn)一步研究松塔球提取物的抑突變作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 蠶豆（Vicia faba L.） 大理市鄧川鎮(zhèn)和灣橋鎮(zhèn)兩地生產(chǎn)的蠶豆。

1.1.2 試劑 云南松（P.yunanensis Fr.）的松塔球堿性提取物I（黑色膏狀物，含木脂素、二萜類等混合物，由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院劉光明教授提供），經(jīng)研磨后，稱取5 mg溶于500 mL的3%乙醇溶液中，配制成1%的云南松提取物I溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?0 mg∕mL環(huán)磷酰胺（CP）；5N HCl溶液；卡諾氏液；Schiff試劑；SO2洗滌液。

1.1.3 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱；顯微鏡；恒溫水浴箱等。

1.2實驗方法

1.2.1 分組 將蠶豆隨機(jī)分成4組：1組為陽性對照組（環(huán)磷酰胺處理組），2組為陰性對照組（蒸餾水處理組），3組為松塔球提取物I處理組，4組為松塔球提取物I+CP處理組。

1.2.2 實驗步驟 對蠶豆進(jìn)行浸泡24 h，25℃溫箱內(nèi)催芽20 h，在初生根長至2～3 mm時，選取發(fā)芽良好的種子繼續(xù)催芽40 h，至種子大部分初生根長至2～3 cm，選擇根毛發(fā)育良好的種子進(jìn)行給藥處理。分別在1組中加入10 mL的環(huán)磷酰胺、2組中加入10 mL的蒸餾水、3組中加入1%松塔球提取物I液10 mL、4組中加入1%的松塔球提取物I液和20 mg∕mL的環(huán)磷酰胺各10 mL的混合液，各處理蠶豆根尖20 h。然后按常規(guī)方法對處理過的蠶豆根尖細(xì)胞進(jìn)行固定、染色、制片、鏡檢。每組分別觀察4個根尖，每個根尖觀察4 000個細(xì)胞，得出微核數(shù)，計算微核率（MCN‰）和微核抑制率（IR%）。IR1%為云南松松塔球提取物對蠶豆根尖微核產(chǎn)生抑制率，IR2%為云南松松塔球提取物對CP誘發(fā)的蠶豆根尖微核產(chǎn)生抑制率。

MCN‰=（測試樣品觀察到的微核細(xì)胞數(shù)∕測試樣品觀察到的細(xì)胞數(shù)）×1000‰

IR1%=［（陰性對照組微核細(xì)胞數(shù)-提取物I組微核細(xì)胞數(shù)）∕陰性對照組微核細(xì)胞數(shù)］×100%

IR2%=［（陽性對照組微核細(xì)胞數(shù)-提取物I+CP組微核細(xì)胞數(shù)）∕陽性對照組微核細(xì)胞數(shù)］×100%

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果

云南松松塔球提取物I對CP誘發(fā)的蠶豆根尖微核率的影響。見表1。

表1 云南松松塔球提取物對CP誘發(fā)的蠶豆根尖微核率的影響

由表1可見，不論是鄧川產(chǎn)蠶豆，還是灣橋產(chǎn)蠶豆，環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核率與陰性對照組微核率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提取物I組和提取物I+CP組分別與陰性對照組和陽性對照組之間的微核率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。松塔球提取物I對鄧川和灣橋產(chǎn)的蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生抑制率均為50%，對CP誘導(dǎo)的兩地產(chǎn)的蠶豆根尖細(xì)胞微核產(chǎn)生抑制率分別為62.5%和50%。

3 討論

松塔中含有萜類、木質(zhì)素類、多糖等多種化學(xué)成分，其中一些化學(xué)組分具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等重要生物活性，可以作為一種新型抗腫瘤藥物〔5〕。云南松松塔中含有某些抗HIV的活性成分，這些成分的提取物可以研制成價格低廉的抗HIV藥物〔6〕；另外的成分如木質(zhì)素、木質(zhì)素-糖復(fù)合物、草莽酸及黃酮等均可以作為一種新的資源加以開發(fā)利用〔7-9〕；其堿性提取物D對腫瘤的防治可能具有積極的作用〔10〕。張志琴等〔11〕通過對云南松松塔中活性成分采用TLC及HPLC進(jìn)行了定性、定量研究，建立了松塔藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為制定松塔的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)新藥提供參考。目前云南松松塔球提取物制成高效的抗腫瘤藥物制劑還在進(jìn)一步研究中。

本實驗結(jié)果說明云南松松塔球提取物對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞微核率有顯著抑制作用，提示云南松松塔球提取物可能具有抗腫瘤作用，但尚需進(jìn)行動物實驗。

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*通信作者：馬志敏，教授.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

Anti mutagenicity of Extracts of the Yunnan Pinecones by Vicia-Micronucleus Test

LIN Mu1,LIU Guangming3,JIANG Xichao4,LI Yunjing5,MA Zhimin2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.College of Agriculture and Biology Science,Dali University, Dali,Yunnan 671003,China；3.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；4.College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；5.School of Public Health,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China）

Objective:To investigate the anti-mutagenicity of the extracts of Yunnan pincones.Methods:Horsebeans from Dengchuan village and Wanqiao village were divided into 4 groups randomly.After the pretreatment,vicia-micronucleus test was applied to explore the anti-mutagenicity of the extracts of pinecones.Results:The extract I of Yunnan pinecone showed 50% inhibition on the Dengchuan fava beans-induced micronucleus,62.5%inhibition on cyclophosphamide-induced micronucleus and 50%inhibition on Wanqiao fava beans root-induced micronucleus.Conclusion:Yunnan pinecone extract effectively inhibited viciamicronucleus induced by cyclophosphamide solution and showed anti-mutagenicity.Thus the extracts of pinecones may have positive effect on tumor prevention.

pinecones extract;anti-mutagenicity;Vica-micronucleus test

B849

A

1672-2345（2014）02-0055-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.02.015

2013-09-26

2013-12-19

林牧，碩士研究生，主要從事病毒感染與免疫研究.