硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）體外產毒條件的篩選

唐亞梅，薛華麗，畢 陽，趙 瑩，沈科萍，王 毅

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

干腐病是我國西北地區馬鈴薯塊莖貯藏期的重要病害[1-5]，多種鐮刀菌（Fusariumspp.）與干腐病的發生相關，其中硫色鐮刀菌（F.sulphureum）是最重要的病原物[5]。該菌具有較強的產生真菌毒素的能力，主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等[6-9]，這些毒素不但引起人畜急性中毒，還具有致癌、致畸、致突變等潛在危害[7,10-13]。環境條件對鐮刀菌的生長具有較大的影響，梨形鐮孢（F.poae）適宜相對干燥溫暖的環境，禾谷鐮孢（F.graminearum）在溫暖潮濕的環境中生長良好，而燕麥鐮孢（F.avenaceum）和黃色鐮孢（F.culmorum）則適宜涼爽和潮濕[15]。玉米串珠鐮孢（F.moniliform）在25℃和pH 5的Richard培養基中培養10 d產毒能力最強[14]；串珠鐮孢（F.moniliform）的最佳產毒條件為馬鈴薯＋葡萄糖培養液、pH 9、12 h光暗交替、25 ℃、培養10 d[15]；尖孢鐮孢（F.oxysporum）在25～30℃的PD培養液中培養15 d具有良好的產毒能力，光照和連續振蕩培養有利于產毒，但pH值對產毒影響不大[16]。進一步的研究表明，27℃最有利于F.oxysporum產毒[17]。 但尚未見F.sulphureum產毒條件的報道。本實驗在培養基種類、pH值、培養方式、溫度和時間5種單因素篩選的基礎上，通過響應面法優化F.sulphureum的最佳產毒條件，并對粗毒素的致病性進行測定，旨在為F.sulphureum的毒素研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試馬鈴薯塊莖（品種：隴薯6號）2012年10月購于渭源縣會川甘肅省農業科學院試驗基地；F.sulphureum由甘肅省農業科學院植物保護所提供；綠豆種子購自華聯連鎖超市蘭州安寧店。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒素濾液的制備

參照魏晉梅等[18]方法，將PDA上培養3～5 d的病菌接種于液體培養基中，在不同條件下培養，雙層滅菌紗布過濾，濾去菌絲體，即獲得具有毒素活性的培養濾液。

1.2.2 粗毒素濃縮液的制備

將最優條件下所得培養濾液及對照旋轉蒸至2 mL，即得粗毒素濃縮液。

1.2.3 體外產毒條件的單因素篩選

參照柴兆祥等[19]方法，采用3個培養溫度（20、25、30 ℃）、3 個培養時間（7、10、17 d）、5 個pH值（3.0、4.5、6.0、7.0、8.0）、2 種培養方式（振蕩（90 r/min）與靜止）及3 種培養基（PSC、Richard、Czapack）研究對F.sulphureum體外產毒的影響。

1.2.4 響應面法優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以綠豆種子胚根平均長度為響應值，選擇對綠豆種子胚根抑制率有顯著影響的3個因素，以培養溫度（X1）、pH值（X2）和培養時間（X3）為自變量，以胚根平均長度為響應值，設計三因素三水平的Box-Behnken響應面分析試驗。

1.3 毒素生物活性測定

1.3.1 濾液毒性測定

參照魏晉梅等[18]方法，用培養濾液對綠豆種子胚根長度的影響表示產毒情況。將大小均勻，顆粒飽滿的綠豆種子用2%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3 次，放入鋪有滅菌濾紙、加入2 mL培養濾液和3 mL無菌水（稀釋度為1∶1.5）的培養皿內，26～28 ℃恒溫、黑暗條件下培養3 d后，測量胚根長度，計算平均值。每處理用種子20 粒，重復3 次。

1.3.2 粗毒素致病性測定

參照楊志敏等[5]方法，選擇大小均勻、無病蟲害、無損傷的馬鈴薯塊莖，清洗后用0.5%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，沖洗后將馬鈴薯塊莖制作成1 cm×3.5 cm的切片，先用無菌水清洗，再用75%酒精擦洗并在酒精燈火焰上灼燒去除多余酒精，置于鋪有已滅菌的濕濾紙的培養皿（內徑17 cm）上，黑暗恒溫恒濕培養2 h后，分別將0.5 mL培養濾液濃縮液、對照濾液、無菌水滴至切片中央，27 ℃恒溫培養4 d后采用El-Hassan等[20]方法調查發病率。每處理用切片8 片，重復3 次。

1.4 數據處理

全部數據采用Microsoft Excel 2003軟件進行統計分析，計算標準差，并采用SPSS Statistics 17.0軟件進行Duncan’s多重差異顯著分析，利用Design-Expert 7.0軟件進行方差分析和二次多項回歸擬合。

2 結果與分析

2.1 5種單因素對F.sulphureum體外產毒的影響

圖1 培養溫度（A）、培養時間（B）、pH值（C）、培養方式（D）和培養基（E）對綠豆胚根長度的影響Fig.1 Effects of temperature (A), time (B), pH (C), aeration (D) and medium (E) on the length of mung bean radicles

由圖1A可知，溫度對F.sulphureum的產毒具有顯著的影響，25 ℃培養濾液處理后的綠豆種子胚根長度分別是20 ℃和30 ℃濾液處理的79.63%、56.21%。由此表明，在20～30 ℃的培養溫度范圍內，25 ℃最有利于F.sulphureum體外產毒。由圖1B可知，培養時間對F.sulphureumt體外產毒具有較大的影響，培養7～10 d時，毒素產量逐漸提高，第10天達到最大，綠豆種子胚根長度分別是7 d和17 d處理的67.75%和84.21%，但進一步延長培養時間毒素產量反而降低。由圖1C可知，pH值對F.sulphureum體外產毒也具有明顯的影響，pH 4.5的培養濾液處理后的綠豆種子胚根長度僅分別是pH 3.0、6.0、7.0和8.0處理的65.10%、52.13%、51.50%和52.24%。由圖1D可知，培養方式對F.sulphureum產毒也有一定的影響，振蕩培養比靜止培養更有利于產毒，振蕩培養濾液對綠豆種子胚根生長的抑制效果比靜止培養高出近1倍。由圖1E可知，在供試的3種培養基中，Richard培養基最有利于F.sulphureum體外產毒，該濾液處理后的綠豆種子胚根長度僅分別是PSC和Czapack培養濾液處理的40.64%和43.88%。

2.2 響應曲面法優化試驗結果

2.2.1 回歸模型的確定

利用Design-Expert 7.0軟件對表1進行二次多項回歸擬合試驗和方差分析，反映培養溫度、pH值和培養時間對綠豆種子胚根平均長度的影響，擬合所得多元二次回歸方程如下：

該方程復相關系數R2為0.973 2，響應變量R2為0.938 8，因此，可以充分描述獨立變量對綠豆胚根平均長度的影響。該模型Prob＞F值為0.000 1，模型極顯著，模型擬合程度良好。

表1 Box-Behnken 響應面試驗分析結果Table 1 Results of Box-Behnken response surface design

2.2.2 回歸方程的方差分析

表2 回歸方程各項的方差分析Table 2 Variance analysis for each item of the regression equation

由表2可知，綠豆胚根長度方程的一次項（除X2外）和二次項極其顯著，說明各具體因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系。交互項X1X3顯著，因此說明X1和X3之間的交互作用很好，整個響應面基于各因素間的交互作用構成。另外，模型的變異系數為15.89%，證明回歸方程擬合程度較好，說明試驗具有很高的可信性和準確性。失擬項不顯著，因此說明實驗的誤差很小。

2.2.3 響應面試驗結果分析及驗證實驗

根據回歸方程預測3個因素對綠豆種子胚根長度的響應曲面圖直觀地反映了各因素對響應值的影響（圖2）。由響應曲面和等高線圖以及回歸方程分析可知，有利于F.sulphureum體外產毒的最佳條件為：溫度22.2℃、pH 5.1、時間12 d，按上述優化條件培養的濾液對綠豆種子胚根的生長抑制良好。

圖2 培養溫度（X1）、pH值（X2）和培養時間（X3）對綠豆胚根平均長度影響的響應曲面圖Fig.2 Response surface plots for the effects of temperature (X1), pH (X2)and time (X3) on the average length of mung bean seed radicles

2.3 粗毒素致病性驗證

由圖3可知，粗毒素濃縮液對馬鈴薯塊莖切片的發病率、病斑直徑分別為37.50%和25.6 mm，而對照和無菌水處理者未見發病。由此表明，F.sulphureum產生的粗毒素對馬鈴薯塊莖切片具有良好的致病力。

圖3 粗毒素對馬鈴薯切片的致病性Fig.3 Pathogenicity of crude toxin on potato tuber slices

3 討 論

本研究結果表明，溫度、時間、pH值、培養方式和培養基對F.sulphureum的產毒均有不同程度的影響。前期本課題組已證明單端孢霉烯族毒素是F.sulphureum最主要的代謝毒素并具有較強的致病能力。25℃最有利于產毒是因為該類毒素的生物合成是典型的生化過程[22]，溫度對酶活性有顯著影響，不同類型的酶均有其作用的最適溫度，低于該溫度酶的活性受到抑制，高于該溫度則使酶變性失活，均不利于產毒[23]。培養10 d最有利于產毒是因為該類毒素的積累在10 d達到最大，隨著培養時間的進一步延長毒素含量減少，可能與毒素在該條件下自我降解有關[14]；此外，菌絲老化也會降低毒素的產量[15]。pH 4.5最有利于該菌生長繁殖，且產生的單端孢霉烯族毒素穩定性良好[7]。振蕩培養有利于產毒是因為振蕩有利于底物或代謝產物更好的在體系內轉移和發揮作用，使培養基中的營養成分有效地得到利用。此外，通過振蕩可以讓更多的氧氣溶解于培養液中，也更有利于菌體生長[24]。

種子的發芽抑制實驗是檢測病原物粗毒素的常用生物學方法之一[25]，但單純通過單因素篩選，很難客觀地反映病原物產毒的最優條件，由于不同的因素之間具有交互作用[26]。因此，采用響應曲面分析試驗可較全面地反映病原菌產毒與環境條件間的關系。本實驗從培養基種類、pH值、溫度、培養方式、培養時間等方面首次系統地研究了影響F.sulphureum體外產毒的因素，明確了該菌產生粗毒素的最優條件，但對體外培養產生的單端孢霉烯族毒素的分離、純化和定性定量分析仍有待于進一步研究。

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