諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體的制備及效價分析

武 娟，趙玉然，唐慶娟,，王靜鳳，王玉明，李兆杰，薛 勇，薛長湖

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，食品科學與人類健康實驗室，山東 青島 266003；2.山東省出入境檢驗檢疫局食品與農產品檢測機構，山東 青島 266003）

諾如病毒（Norovirus，NV）是目前最為常見的食源性病毒之一，是一種單鏈RNA病毒。流行病學調查提示牡蠣等雙殼貝類是諾如病毒最主要的食物性傳播載體[1]。到目前為止，全世界范圍內已報道了數十起食用諾如病毒污染的牡蠣導致的流行性腹瀉爆發事件，嚴重影響了牡蠣的食品安全性[2-7]。近年來，不少國家要求進口的凍貝產品不得攜帶諾如病毒。我國的貝類產量居世界首位，建立適用于大規模貝類中諾如病毒快速檢測的新方法意義重大。

目前，逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）技術是國內檢測諾如病毒最主要的手段[8]。但是該技術對儀器設備和檢測者的技能均有較高要求，在基層單位很難推廣，而且所需時間較長，難以滿足貝類產品現場快速檢測的要求。另外一種常用方法是酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。國內外研究者利用基因工程方法獲得多種基因型的諾如病毒衣殼蛋白或合成肽，聯合免疫動物后獲得特異性免疫血清，建立了商品化的酶聯免疫檢測試劑盒[9-11]。由于該方法成本較高，導致試劑盒價格昂貴，不適合在價格相對低廉的貝類產品檢測中推廣。本實驗室在前期工作中利用大腸桿菌系統原核表達了GⅡ-4型諾如病毒衣殼蛋白，表達和純化的流程相對簡單且操作容易，成本較低[12]。本研究擬利用原核表達的諾如病毒重組衣殼蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，在此基礎上建立相應的ELISA檢測方法，為實現水產品中諾如病毒的快速檢測目標提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾如病毒衣殼蛋白由本實驗室通過大腸桿菌表達NV GⅡ-4型衣殼蛋白基因獲得[12]。非細菌性腹瀉病人糞便樣品由青島市兒童醫院提供。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；TMB底物 加拿大Bio Basic公司；HRP-羊抗兔IgG北京博奧森生物技術有限公司；吐溫-20 青島碧海生物試劑有限公司；其他化學試劑均購自上海Sangon公司。

1.2 儀器與設備

島津UV2550紫外分光光度計 日本島津公司；Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；96孔12道可拆聚苯乙烯酶標板 青島碧海生物試劑有限公司；CliniBio 128C酶標儀 奧地利ASYSHitech有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物免疫與NV抗血清的制備

將原核表達的諾如病毒衣殼蛋白，免疫新西蘭大白兔。采用背部4點注射免疫，第1次每只注射2 mg/mL抗原，免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合乳化；2、3、4次免疫每只注射1 mg/mL抗原，用弗氏不完全佐劑乳化注射家兔；第5次直接注射蛋白溶液1 mg/mL。每次免疫相隔14 d。第5次免疫前，耳靜脈采血，間接ELISA方法測定效價。第5次免疫后7 d，頸動脈放血，分離血清，-20 ℃凍存。

1.3.2 諾如病毒抗血清效價的ELISA檢測

將諾如病毒衣殼蛋白溶液透析24 h之后真空凍干24 h，稱質量后溶于5 mg/mL碳酸鹽緩沖溶液（carbonate buffer solution，CBS）中用作包被抗原。包被抗原和抗體最佳濃度的測定用抗原包被96孔板，按方陣滴定法測定包被抗原和抗血清反應的最佳工作濃度，測定OD450nm值。根據曲線圖，選擇OD450nm值在1.0左右的抗原包被物濃度和酶標抗體的稀釋度為最適工作濃度。

ELISA操作參照文獻[12]步驟如下：1）NV衣殼蛋白稀釋至20 μg/mL包被96孔板，4 ℃過夜，洗板；2）封閉液（1×PBST，0.5%牛血清白蛋白）封閉，37 ℃作用1 h，洗板；3）NV抗血清用pH 7.4、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000、1∶14 000的比例稀釋后，加入待測樣品孔，空白孔加pH 7.4、0.01 mol/L的PBS緩沖液，陰性對照孔加免疫前采集的兔血清，37 ℃作用1 h，洗板；4）加入3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液顯色，測定OD450nm值，通過Excel軟件作圖并計算各種稀釋度下的P/N值，以P/N值大于2.0者為陽性，P/N值接近2.0的抗血清稀釋度為該抗體效價。

1.3.3 諾如病毒ELISA法與PCR法的比較

取經RT-PCR方法（采用引物P289/290[13]）驗證為諾如病毒GⅡ型陽性的糞便樣品4份，其中3株為諾如病毒GⅡ-4型，1株為諾如病毒GⅡ-3型，陰性樣品2份，作為包被蛋白進行包被，用諾如病毒抗血清對其進行ELISA檢測。本實驗采用4個對照組，對照組1與對照組2為2份陰性樣品包被抗原，對照組3與對照組4為2份陽性樣品包被抗原，對照組1與對照組3添加陰性血清，對照組2與對照組4添加陽性血清，血清均按照1∶1 000進行稀釋，空白組添加PBS。通過每個對照組之間的反應，驗證抗血清對陽性樣品的檢測能力。

2 結果與分析

2.1 抗血清效價的ELISA檢測結果

圖1 抗血清效價的測定Fig.1 Determination of antiserum titer

用間接ELISA方法測得抗血清效價，如圖1所示，所制備的兔抗NV衣殼蛋白效價可達到1∶10 000，可以滿足免疫檢測的要求。

2.2 ELISA法與PCR法對諾如病毒檢測的結果比較

通過4個對照組的抗原抗體反應，測定OD450nm，并計算各種對照組條件下的P/N值，結果見表1，只有陽性樣品與陽性血清反應結果出現陽性，其余為陰性。在所檢測的糞便樣品中，4份經PCR檢測為NV GⅡ型陽性的糞便樣品中，僅1份樣品可通過ELISA方法檢測為陽性樣品，P/N為2.0。而其余3份經PCR驗證為NV陽性的糞便樣品，P/N均小于2.0，檢測結果為陰性。這說明本實驗所得的抗血清特異性比較好，其檢測范圍亦較窄。因此，在此抗體基礎上的ELISA方法檢測實際糞便樣品時，其檢出率較PCR方法低。

表1 ELISA法與PCR法對諾如病毒4個對照組P/N檢測結果的比較Table 1 Comparison of P/N results of four control groups detected by ELISA and PCR

通過ELISA檢測方法與PCR檢測方法初步比較，可以看出ELISA檢測方法對實際糞便樣品的檢出率較PCR方法低，這與Jiang等[9]通過VLPs制備的諾如病毒單抗對實際糞便樣品的檢測率非常低的報道相一致。推測其中原因可能是由于糞便樣品中雜蛋白的干擾，或病毒濃度過低所致，且NV變異性強，一種遺傳組型抗體不能識別其他組型抗原，對自身遺傳組型抗原的識別也因衣殼蛋白的差異性受到限制，且檢出率相對較低。同時，由于PCR檢測NV病毒時，病毒是經過提純的，相對濃度要遠遠高于實際糞便樣品。PCR檢測結果與NV特異探針雜交結果的比較以及PCR陽性與被檢者感染NV的一致性都顯示用RT-PCR方法具有很高的靈敏度[13]，因此不能簡單地將PCR檢測方法與ELISA檢測方法進行比較。因此本實驗結果提示，用ELISA法檢測水產品中諾如病毒時，首先需要對病毒進行濃縮提純。

3 討 論

NV GII-4型是我國諾如病毒主要流行株之一[14-15]，但目前還沒有關于NV GⅡ-4型抗血清的報道。1992年，Jiang等[9]用重組桿狀病毒表達了NV衣殼蛋白（rNV），rNV在昆蟲細胞中自動組裝成病毒樣顆粒（virus like particals，VLPs），此方法可以大量獲得與病毒形態和抗原性相似的VLPs。但根據2000年Yoda等[16]對NV衣殼蛋白抗原表位的研究表明，NV衣殼蛋白的保守區域位于N末端，在VLPs中比較保守的N端被包裹在內，而變易比較大的C端暴露在外，因此免疫動物產生的抗體也是主要針對病毒衣殼蛋白C端抗原，這樣就限制了抗體識別其他型病毒的能力，而原核表達的可融性的衣殼蛋白，N端和C端的抗原表位均很好的暴露，免疫動物得到的抗體可以識別衣殼蛋白的各區，因此通過原核表達NV衣殼蛋白而獲得的多克隆抗體將具有更廣泛的檢測范圍。2001—2003年Yoda等[10-11]又通過原核表達的衣殼蛋白制備了單克隆抗體，發現GⅡ衣殼蛋白制備的單抗其抗原表位可以很好的識別GⅠ、GⅡ型的NV衣殼蛋白N端40個氨基酸，它們的抗原表位來自于N末端暴露在外的氨基酸（QQNIIDPWIMN）肽。更加表明原核表達的NV衣殼蛋白具有不可替代的優越性。本實驗室采用Yoda等[10-11]提出的諾如病毒原核表達系統表達諾如病毒衣殼蛋白，制備多抗。通過DNAtools的分析，不存在終止密碼子突變，該衣殼蛋白基因能夠完整的被翻譯。在該蛋白質序列中存在Yoda等[10-12]提出的N末端11個保守氨基酸（QQNIIDPWIMN），該11個保守氨基酸位于諾如病毒衣殼蛋白抗原表位，以此蛋白免疫動物獲得的抗血清，理論上比通過VLPs免疫獲得的抗血清具有更廣的檢測范圍。

由于多抗的制備具有抗原制備快，耗時短，操作安全，成本低廉，制備難度低的特點，在此基礎上開發試劑盒有經濟適用的優點，對于大量、低廉水產品（如牡蠣）的檢測有著單抗不可代替的優越性[12]。在我國，針對諾如病毒食品檢測方面的應用，制備NV多抗還未見報道。本實驗采用間接ELISA方法，方法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。多抗相對于單抗，更容易捕捉抗原，因為含有抗不同表位的抗體，此外通過大腸桿菌表達的衣殼蛋白抗原表位又全部展露在外，以此制備的多克隆抗體相對于VLPs將具有更廣泛的識別范圍，在一定程度上可以減少試劑盒制備過程中需要表達病毒株的基因組型[12]。因此，本實驗制備了NV衣殼蛋白的多抗，以期能獲得成本低廉且檢測范圍廣的高效酶聯免疫檢測試劑盒。通過將大腸桿菌表達的諾如病毒衣殼蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得諾如病毒抗血清，并通過間接ELISA方法對抗血清效價進行檢測，結果表明，該抗血清效價可達到1∶10 000，能夠滿足免疫檢測的要求。目前所用ELISA檢測間接法一般標本用量為5～10μL，在檢測孔中作10～20倍稀釋，之所以作高比例的稀釋，主要是受間接法固有的缺點限制，因為如果血清濃度過高，血清中存在的大量免疫球蛋白對酶標板的非特異吸附會造成陰性標本本底很高，無法對實驗結果有效判斷。在ELISA檢測中，用樣品稀釋液調整反應成分的濃度，調節適宜的OD值范圍，為免疫反應提供適宜的環境，降低非特異吸附，抑制非特異反應等，提高特異性反應和檢測的靈敏度，提高免疫學檢測技術的可行性，以獲得正確的結果。因此，ELISA檢測方法的條件優化及方法學評價是至關重要的。

本實驗通過ELISA檢測方法與PCR檢測方法初步比較，得出ELISA檢測方法對實際糞便樣品的檢出率較PCR方法低，提示ELISA法檢測水產品中諾如病毒時，需對病毒進行濃縮提純。吳斌等[17]通過用熒光定量PCR法和ELISA法檢測貝類中的諾如病毒，得出這兩種方法都可以用于快速檢測諾如病毒，但ELISA法更適于檢測諾如病毒含量低的樣品。然而由于諾如病毒的基因型的多樣性和復雜性，設計出具有特異性和廣泛適用性的引物已成為RT-PCR檢測的關鍵。各國實驗室大多是以ORF1編碼病毒RNA多聚酶上的保守區段為靶序列來設計引物，但這種方法不具有絕對優勢，研究者們致力于尋找檢測能力較好的引物。對諾如病毒的PCR擴增，首先要提取諾如病毒的RNA，RNA非常不穩定，暴露在空氣中很容易降解，糞便樣品中的蛋白質、脂肪、金屬離子等都是能夠抑制反轉錄酶和DNA聚合酶活性的物質，因此在進行RT-PCR之前有必要對病毒核酸進行高效率的提取純化。雖然PCR檢測方法靈敏度高、特異性好，但是該方法并不適合大量產品短時間內的檢測，仍然需要繁瑣的實驗操作與成本較高的測序過程，因此建立NV的ELISA檢測試劑盒還是有其必要性的。

由于NV病毒具有較強的變異性，同一遺傳組型不同病毒株在衣殼蛋白區域可能存在較大差異，在實際檢測過程中抗體病毒株型與實際傳播的病毒株型也可能存在較大的差距，因此后期本實驗難以找到合適的糞便樣品以進行抗血清特異性的進一步研究，這就增加了諾如病毒檢測的難度[16]。雖然原核表達的衣殼蛋白制備的抗血清理論上檢測范圍較VLPs制備的抗血清檢測范圍廣，但是諾如病毒多抗檢測試劑盒的研制還需要針對我國流行的GGⅡ3、GGⅡ1和GGⅡ7型病毒衣殼蛋白多抗的獲得，以及對抗體交叉反應、特異性和靈敏度的進一步檢測。本實驗室還將在以后的工作中不斷完善該檢測方法。

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