超高效液相色譜串聯質譜同時測定酒類產品中多種人工合成甜味劑

周 彬，呂任一，肖麗恒，李 萍，何學梅，楊 芩，楊麗娜

（楚雄州質量技術監督綜合檢測中心，云南 楚雄 675000）

酒是糧食或水果經發酵而成的飲料，富含人體需要的營養成分，適量飲用能預防多種疾病。隨著我國人民生活水平的提高，酒的消費量呈現了快速增長的趨勢，酒中添加人工合成甜味劑的安全性備受消費者的關注[1-3]。為了保障酒的飲用安全，GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》對酒中允許添加的食品添加劑種類和濃度作了明確規定，其中規定不允許人工合成甜味劑添加到蒸餾酒酒中[4]。然而，一些不法生產者向酒中非法添加人工合成甜味劑的情況卻時有發生[5]，因此建立一種快速、準確、靈敏地測定酒中多種甜味劑同時檢測的分析方法，對于保障酒的飲用安全尤為重要。

目前食品中經常使用的人工合成甜味劑包括糖精鈉（saccharin sodium，SA）、甜蜜素（sodium cyclamate，SC）、安賽蜜（acesulfame-K，AK）、三氯蔗糖（sucralose，SL）、阿斯巴甜（aspartame，ASP）、阿力甜（alitame，ALT）和紐甜（neotame，NTM）等。隨著儀器分析技術的發展，針對這些甜味劑的檢測方法，已報道的有高效液相色譜-紫外分光光度法[6-15]、高效液相色譜-蒸發光檢測法[16-18]、薄層色譜法、離子色譜法[19-22]、氣相色譜法[23-26]、高效液相色譜-質譜法[27-36]等。其中高效液相色譜-紫外分光光度法較為常用，主要檢測的甜味劑有安賽蜜和糖精鈉，但由于受到紫外分光光度法靈敏度的限制，部分甜味劑可能因含量較低而無法檢出；而且該方法不能提供結構信息，在實際樣品分析時容易受到基質干擾而產生假陽性現象。高效液相色譜-蒸發光散射法檢測人工合成甜味劑，檢測靈敏度不高，對酒中低含量的人工甜味劑不能檢出。氣相色譜法檢測甜味劑需要衍生化，操作繁瑣。近來，采用高效液相色譜-質譜法對食品中的甜味劑進行分析已有一些報道，但是這些方法尚存在分析種類少、消耗時間長、分離度差等不足[27-32]。鑒于此，本實驗建立了一種檢測酒中多種人工合成甜味劑的高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）檢測方法。該方法處理樣品方式簡單，分析速度快，靈敏度高，適用于酒類產品中人工合成甜味劑的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒、黃酒、啤酒、葡萄酒 市購；糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜蜜素、阿力甜、紐甜（標準品純度＞95%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Mreda公司。

1.2 儀器與設備

1260型超高效液相色譜-6460三重串聯四極桿質譜儀、液相色譜儀（配有G1367E自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1322A在線脫氣機）、質譜（電噴霧離子源（elector spray ionization，ESI） 美國Agilent公司；LA204、CPA225D分析天平 美國梅特勒-托利多公司；離心機（最大轉速10 000 r/min） 湖南省凱達科學儀器有限公司；AS20500AT超聲波提取機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PGC-01D氮吹儀 德州市昊誠實驗儀器有限公司；純水儀 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 貯備溶液

準確稱取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜10 mg標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液溶解并定容，阿斯巴甜用甲醇和pH值為4.5的甲酸溶液溶解并定容，配制成質量濃度1 mg/mL的單標貯備溶液。

1.3.2 使用標準溶液

準確移取儲備液100 μL混合于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液稀釋配制成10 mg/L的中間標準工作液。阿斯巴甜用甲醇和pH值為4.5的甲酸水溶液稀釋定容，精密量取適量的中間標準工作液，根據色譜峰響應值用流動相配制成不同質量濃度混合標準工作溶液。現用現配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Z O R B A X E c l i p s e X D B-C18柱（100 mm×4.6 mm，1.8 μm）；柱溫：50 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A相為甲醇，B相為體積分數0.1%甲酸和20 mmol/L甲酸銨溶液，pH 4.0；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 質譜條件

離子源：ESI負離子模式；干燥氣流速：11 L/min；噴霧器：45 psi；干燥氣溫度：300 ℃；毛細管電壓：4 000 V；碰撞誘導解離電壓：可變電壓200 V；檢測模式：多反應監測。實驗中所用的氣體均為液氮和高純氮氣。

1.3.5 樣品處理方法

1.3.5.1 白酒和黃酒

用分析天平準確稱取均勻白酒和黃酒樣品10 g于10 mL比色管中，用水浴加熱氮吹儀除去乙醇，用10 mL的容量瓶中，用水定容至10 mL，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機分析。

1.3.5.2 啤酒

啤酒樣品10 g置于50 mL比色管中，超聲脫氣10 min，用水定容至10 mL，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機分析。

1.3.5.3 葡萄酒

準確稱取葡萄酒10 g于50 mL離心管中，使用超聲波超聲排氣，然后用離心機以6 000 r/min 速率離心5 min去除大分子物質，上層清液用0.22 μm的針頭過濾器過濾，濾液待上機分析。

若樣品中所檢測的人工合成甜味劑質量濃度過高，應將溶液用超純水進行適當倍數的稀釋，使其在標準曲線范圍內進行測定。

1.3.6 樣品測定方法

將處理好的待測液放入自動進樣器的樣品盤上，進樣器自動進樣10 μL，數據采集采用Agilent Mass Hunter Data Acquisition工作站進行采集處理。采用QQQ Quantitative Analysis軟件，使用外標法進行數據分析，得出樣品溶液中人工合成甜味劑的質量濃度。再根據下列公式得出檢測結果。

結果計算公式：

式中：W為試樣中各檢測組分的含量/（mg/kg）；V為樣品提取液的總體積/mL；ρ為由標準曲線上查得進樣液中所測得量/（mg/L）；m為試樣的質量/g。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

表2 7 種甜味劑檢測的質譜條件Table 2 MS-MS conditions for the detection of 7 synthetic sweeteners

將一定質量濃度的待測物標準品溶液分別通過注射進樣泵連續注入質譜，在ESI負離子方式下采用不同的碎裂電壓對各分析物進行一級質譜全掃描，得到各分析物的分子離子峰和最佳的碎裂電壓，然后使用碰撞氣使其分子離子被碰撞活化解離，使用二級質譜掃描其子離子，得到各分析物的子離子。確定每種待測物的監測離子對，再采用多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）方式監測各離子對，調節質譜參數使各信號最強，得最佳質譜條件見表2。

2.2 色譜條件的優化

采用乙腈-體積分數0.1%甲酸水體系作為流動相，進行梯度洗脫分析時，安賽蜜、糖精鈉以及三氯蔗糖和阿斯巴甜不能達到良好的分離效果；采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨體系和甲醇-5 mmol/L乙酸銨體系下7 種甜味劑能分離。但是分析時間太長，安賽蜜、糖精鈉以及三氯蔗糖色譜峰拖尾嚴重；當采用甲醇-體積分數0.1%甲酸體系作為流動相，進行梯度洗脫分析，7 種人工合成甜味劑的峰形對稱良好，響應強度高，分離度好，在優化的色譜與質譜條件下7 種人工合成甜味劑的多重反應監測色譜圖見圖1。

圖1 7種人工合成甜味劑混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed solution of 7 synthetic sweetener standards

2.3 樣品處理條件的選擇

7 種人工合成甜味劑都能很好的溶于水中，因為樣品的復雜性，根據樣品的不同采用不同的提取方法。

白酒和黃酒的主要成分是水和乙醇，在進行直接進樣批量檢測時，乙醇會縮短目標物從色譜柱上洗脫出來的時間，從而使保留時間不穩定，會發生向前移動，為了消除乙醇對檢測結果的影響，于是就將白酒和黃酒中的乙醇用氮吹儀50 ℃加熱氮吹去除，用超純水定容，用0.45 μm的針頭過濾器過濾進行檢測。

對于啤酒開蓋后，產生大量的泡沫，也不能進行直接檢測，在進行檢測前，要采用超聲波超聲排除氣泡，再過針頭過濾器后進行檢測。

葡萄酒成分復雜，含有大量的天然色素和有機物，在樣品處理時，使用超聲波超聲排氣，在用離心機離心去除大分子物質，上清液過0.22 μm的針頭過濾器過濾，濾液供UPLC-MS-MS進行檢測，效果良好。

2.4 添加回收率和方法精密度

采用建立的方法在檢測樣品中添加10、20、30 μg/kg的7 種食品添加劑混合標準溶液，按方法進行回收率實驗，每個添加水平重復測定6 次，計算添加平均回收率和相對標準偏差，結果見表3。7 種食品添加劑的平均回收率在88.3%～98.3%之間，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）為2.1%～6.7%。方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表3 樣品中7種甜味劑的添加回收率及其相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 7 synthetic sweeteners in spiked samples (n=6)

2.5 方法的線性范圍和檢出限

表4 7種目標分析物的線性關系和定量限（RSN=3）Table 4 Linear relationships and limits of quanti fication (LOQ, RSN =3)of 7 synthetic sweeteners

對7 種人工合成甜味劑的質量濃度在0.01～5 mg/L之間的混合標準溶液進行測定，得到一系列不同質量濃度的色譜圖，并以目標組分的峰面積y對相應的質量濃度x（mg/L）繪制標準曲線，相關系數（r）都在0.999以上。用信噪比（RSN）為3時，作為方法的定量限（limit of detection，LOQ）、線性方程、相關系數和定量限見表4。

3 結 論

本實驗應用超高壓液相色譜-串聯質譜建立了同時測定酒類產品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜7種人工合成甜味劑的方法。將該方法用于酒類產品中低含量的人工合成甜味劑的測定，樣品前處理步驟簡單、分離度好、靈敏度高、精密度好、準確度高。在實際檢測過程中發現，在一些酒中的人工合成甜味劑有糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、紐甜。該法的建立為酒類產品提供可靠而準確的分析方法，為酒類產品的質量控制和安全評價提供科學依據，在保障食品安全方面有著重要的現實意義。

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