一種檢測沙丁胺醇的高靈敏復合納米免疫電化學傳感器的研制

吳 珺，張 潔,，邵科峰，陳昌云，王傳現，趙 波,

（1.南京師范大學化學與材料科學學院，江蘇 南京 210023；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

沙丁胺醇又名1-（4-羥基-3-羥甲基苯基）-2-（叔丁氨基）乙醇，其結構式見圖1。沙丁胺醇是β-激動劑系列的一種，對治療哮喘有一定的作用。沙丁胺醇也可以促進動物生長的速率，同時能增加瘦肉的產量[1-3]，因此被不法分子添加到動物的飼料中。但是人類在食用含沙丁胺醇的肉制品時，沙丁胺醇會在人體內富集。沙丁胺醇會產生肌肉顫抖、心悸、頭痛、肌肉疼痛、惡心、嘔吐、發燒等副作用[4-6]。基于以上原因，中國和許多歐洲國家都已經明令禁止使用沙丁胺醇等β-激動劑系列[7]。

目前，食品中β-激動劑的檢測方法主要有液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法以及酶聯免疫法[8-17]，這些方法都具有前處理復雜，價格昂貴以及攜帶不方便等缺點。免疫生物傳感器是利用生物活性物質的專一識別功能，有選擇地檢測待測物。以靈敏度高、選擇性好、分離過程和檢測技術合為一體、不需要樣品預處理或簡單處理便能直接應用于復雜樣品的檢測等特點而受到廣泛重視，成為臨床、生物醫藥、環境化學以及食品安全分析中一種有力的分析手段。納米材料因其具有獨特的電子特性和表面微結構，較大的比表面積、較高的表面活性、強吸附力、較高催化效率以及良好的生物相容性等優異特性[18-19]，可在增加生物分子（酶、抗原或抗體等）[20-23]的吸附量和穩定性的同時提高生物分子的催化活性，很好地促進生物電活性分子的電子傳遞，使傳感器或納米免疫分析的響應靈敏度大大提高，成為現代化學分析的重要發展方向之一。

納米金具有大的比表面積，優異的光學性能以及良好的生物兼容性而被廣泛用于電化學傳感器[24-26]，并且其具有良好的導電性，能有效提高電子的傳輸。石墨烯作為一種具有二維結構的新型碳基材料，因其具有更大的比表面積及高電子傳導能力、原料易得且價格便宜等優點，已成為繼碳納米管后新一代的理想電極修飾材料。本實驗將納米技術和免疫分析方法有機結合，研究開發了一種高靈敏、高選擇性、低成本、快速現場的新型多殘留復合納米免疫分析檢測技術。本實驗旨在發展β-激動劑類獸類藥物殘留技術的創新提供參考，為我國β-激動劑類獸殘檢測和監管作出貢獻，同時也可為其他農獸殘檢測提供一種先進的通用技術，具有很大的社會效益和應用價值。

圖1 沙丁胺醇結構Fig.1 Molecular structure of salbutamol

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙丁胺醇 美國Sigma-Aldrich公司；沙丁胺醇抗體深圳華英生物技術有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣馬生物技術研究所；氯金酸 南京化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）由0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4溶液按一定比例配得；提取液是乙腈與丙酮以4∶1的體積比配得。其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

CHI852C電化學工作站、三電極體系（工作電極為玻碳電極，對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極） 上海辰華儀器有限公司；PHS-25型pH計 上海今邁儀器儀表有限公司；UV1700PC紫外-可見分光光度計 上海鳳凰光學科儀有限公司；FA1004分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；JSM-7600F高分辨熱場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 石墨烯懸濁液的制備

1.3.1.1 氧化石墨烯制備

將50 mL濃H2SO4、10 g K2S2O8、10 g P2O5混合，將12 g石墨粉加入到上述混合液中，反應6 h。加入2 L水，過夜。將460 mL濃H2SO4冰箱冰凍處理備用，將氧化的石墨粉加入到濃H2SO4中攪拌。溫度控制在10 ℃以下，緩慢加入60 g KMnO4，混合物在35 ℃反應2 h，緩慢加入920 mL去離子水，保持50 ℃以下，攪拌反應2 h。加入2.8 L水以及50 mL 30% H2O2，攪拌反應1 d。使用5 L 10%的HCl溶液沖洗，離心。然后再用5 L水洗，至溶液呈中性。

1.3.1.2 石墨烯的制備

稱取上述氧化石墨0.05 g，加入到100 mL pH 11的NaOH溶液中；150 W超聲90 min制備氧化石墨烯分散液；在4 000 r/min離心3 min除去極少量未剝離的氧化石墨；向離心后的氧化石墨烯分散液中加入0.1 mL水合肼，在90 ℃攪拌反應2 h，得到石墨烯分散液。

1.3.1.3 石墨烯懸濁液的制備

稱取10 mg的石墨烯于10 mL離心管中，加入4 mL的二次蒸餾水，超聲使其分散均勻，制得石墨烯懸濁液，放入4 ℃的冰箱內備用。

1.3.2 電極的制備

將玻碳電極GCE（Φ=3 mm）在1.0 μm和0.3 μm Al2O3拋光粉上拋光成鏡面，并分別在二次蒸餾水、乙醇與二次蒸餾水混合液、二次蒸餾水中清洗干凈，室溫晾干，備用。

1.3.3 紫外-可見光譜的測定

1.3.3.1 標準溶液的配制

準確稱取0.005 g沙丁胺醇，溶于10 mL無水乙醇中，配得0.5 g/L的沙丁胺醇溶液。用無水乙醇對上述標準液進行稀釋，得到0.01 g/L的沙丁胺醇溶液。以無水乙醇為參比液，對0.01 g/L的沙丁胺醇標準液進行全波長掃描。

1.3.3.2 石墨烯-沙丁胺醇復合物以及石墨烯懸浮液的制備

先將石英片清洗干凈，晾干，然后取制備好的石墨烯懸濁液300 μL和150 μL的質量濃度為0.1 g/L的沙丁胺醇混合后滴加到石英片上，并在40 ℃烘干。待烘干后用5%的牛血清白蛋白封閉活性位點。最后用磷酸緩沖溶液沖洗，室溫晾干。

同樣樣取300 μL的石墨烯滴加到石英片上，其他步驟同上。

將前面得到的固體刮下，置于10 mL的離心管中，加入9 mL的去離子水，超聲使其均勻分散。

1.3.3.3 紫外-可見光譜的測定

以去離子水為參比液，對上述得到的兩種分散液進行全波長掃描。

1.3.4 電化學表征

將清洗干凈備用的玻碳電極沉積納米金，在100 mg/L的HAuCl4溶液中在－0.2 V電勢下恒電位60 s，取4 μL石墨烯懸濁液和2 μL 0.1 g/L的沙丁胺醇溶液的混合液滴涂于鍍金后的玻碳電極上，室溫晾干。最后用質量分數為5%的牛血清白蛋白封閉活性位點。

利用循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）研究了不同修飾電極的電化學行為，電位范圍為－0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s；運用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）對孵育時間、抗體用量進行了優化，電位掃描范圍在－0.2～0.5 V，脈沖幅度為50 mV，脈沖寬度為50 ms，并在優化實驗條件下運用DPV進行線性范圍測定、樣品回收率測定。所有實驗均在室溫條件下進行。實驗原理見圖2。

圖2 納米金-石墨烯復合物修飾電極的免疫傳感器檢測沙丁胺醇的原理Fig.2 Principle of the modified immunosensor for salbutamol detection

1.3.5 樣品的前處理

稱取（1±0.005 0） g實際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）于10 mL的樣品管中，加入沙丁胺醇標準液和3 mL乙腈-丙酮提取液（V（乙腈）∶V（丙酮）=4∶1），混合物超聲振蕩30 min，于2 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至氮吹管中，殘渣用3 mL的相同提取液重復提取1 次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下濃縮蒸發，濃縮物加入1 mL的pH 7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學分析。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜

圖3 電極表面修飾材料紫外-可見光譜Fig.3 Ultraviolet-visible spectra of surface-modifying materials

取0.01 g/L的沙丁胺醇標準液，以無水乙醇為參比液，進行全波長掃描，得到其在226 nm波長處有吸收峰，吸光度為0.469。見圖3曲線a。以去離子水為參比液，對石墨烯及石墨烯-沙丁胺醇的分散液進行全波長掃描，圖3曲線b、c，可以知道，石墨烯在226.5 nm波長處沒有吸收峰，而石墨烯-沙丁胺醇的混合液在226.5 nm波長處有紫外吸收峰（峰值為0.310），因此石墨烯-沙丁胺醇混合液表現出沙丁胺醇的性質。

2.2 納米金和石墨烯的掃描電鏡分析

圖4 掃描電鏡圖Fig.4 SEM images

從圖4A可以看出，納米金均勻的分散在電極表面，尺寸在50～400 nm之間。從圖4B可以看出，石墨烯呈很薄的片狀。石墨烯由一層密集的、包裹在蜂巢晶體點陣上的碳原子組成，是世界上最薄的二維材料，其厚度僅為0.335 nm。

2.3 修飾電極的電化學行為

圖5 不同修飾電極的CV曲線圖Fig.5 CV curves of different modified electrodes

將清洗干凈的玻碳電極在2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中掃描循環伏安法，電位范圍為－0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s，圖5曲線a，裸電極具有一堆明顯的可逆的氧化還原峰。再將修飾上石墨烯的玻碳電極以相同參數掃描循環伏安法，由于石墨烯具有優異的電化學活性，大的比表面積，突出的導熱性能，增強電子的傳遞，因此峰值會增大（曲線b）。當電極上修飾了納米金-石墨烯-沙丁胺醇后，峰電流明顯增大，如曲線c所示，這是由于納米金顆粒具有良好的生物相容性，高的表面積和導電性，進一步增強了電子的傳遞。最后將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極在含量為50 μL的沙丁胺醇單克隆抗體中孵育40 min，由于電極上修飾的沙丁胺醇半抗原和抗體結合，阻礙了電極傳遞，見曲線d，說明沙丁胺醇半抗原已經被固定在電極上。

2.4 實驗條件的優化

2.4.1 反應時間

不同檢測條件的影響，如免疫反應的時間對免疫的影響，分別取0、5、10、15、20、25、30、35 min，利用差分脈沖伏安法（電位掃描范圍－0.2～0.5 V，脈沖幅度50 mV，脈沖寬度50 ms）得時間與孵育電流之間的關系，圖6，其中0～35 min之內，電流值在逐漸減小，說明抗體和沙丁胺醇特異性結合，30～35 min之間電流值達到過飽和狀態，說明抗體已經和沙丁胺醇充分特異性結合，繼續增加孵育時間對DPV峰電流響應沒有明顯的影響。因此選擇30 min為后續實驗的最優時間。

圖6 孵育時間對差分脈沖伏安法電流值的影響Fig.6 Relationship between incubation time and differential pulse voltammetry current

2.4.2 抗體量

圖7 抗體量對差分脈沖伏安法電流值的影響Fig.7 Relationship between antibody volume and differential pulse voltammetry current

在上述最優時間為30 min條件下，通過改變沙丁胺醇單克隆抗體的體積量，利用差分脈沖伏安法（電位掃描范圍－0.2～0.5 V、脈沖幅度50 mV、脈沖寬度50 ms）得抗體量與孵育電流之間的關系，見圖7，其中在0～7 μL之間，電流值逐漸降低，這是由于沙丁胺醇和抗體特異性結合，7～9 μL，電流值基本不變化，說明抗體已經基本和沙丁胺醇完全特異性結合，抗體量基本達到飽和狀態，因此以后的實驗中取7 μL為后續實驗的最佳抗體量。

2.5 線性范圍和檢測限

規定納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極在只含7 μL抗體的PBS緩沖溶液中孵育后的響應電流為I0，在含有一定量游離的沙丁胺醇的孵育液孵育后的響應電流為Ix，響應電流的增加ΔI=Ix－I0。在最優化的條件下，測定了沙丁胺醇質量濃度和響應電流增加值ΔI的線性關系，見圖8，隨著溶液中游離的沙丁胺醇質量濃度增加，抗體與電極上修飾的沙丁胺醇結合量越小，導致Ix減小，因此響應電流的增加量越大。結果表明，ΔI與沙丁胺醇質量濃度在1×10－6～5×10－3g/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=0.767 75+0.002 04X（r=0.972 12），檢測限為2×10－7g/L。

2.6 修飾電極的重復和穩定性

圖9 修飾電極的重復性Fig.9 Stability of the modified electrode

對沙丁胺醇免疫傳感器的重復性進行了研究，將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極重復11 次差分脈沖伏安法掃描，其峰電流變化相對標準偏差小于10%，見圖9，說明實驗重復性較好。

對免疫傳感器的穩定性，將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極存放在PBS中，每天進行氧化還原標記的差分脈沖伏安法掃描，結果顯示峰電流在8 d內降低值小于10%，見圖10，說明制備的電極穩定性較好。

圖10 修飾電極的穩定性Fig.10 Repeatability of the modified electrode

2.7 對實際樣品的分析

對4 種加入不同量沙丁胺醇標準液的實際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）進行實驗所述的前處理，進而進行測定，對每個添加量測定3 次，根據標準曲線，沙丁胺醇的回收率統計結果見表1。分析上述回收率總結得到，牛肉的回收率為92.4%，鴨肉的回收率為91.2%，豬肉的回收率為94.9%，豬肝的回收率為102.2%，其中豬肝的回收率最高。這是由于豬肝是食物排毒代謝的重要器官，沙丁胺醇易于在肝臟內聚集，所以具有很高的回收率。由此也可以知道，肝臟中積累有害物質的量會比其他部位要多。

表1 實際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）加標處理測試沙丁胺醇實驗結果Table 1 Recoveries of salbutamol from spiked real samples of beef,pork, duck and pork liver

3 結 論

本實驗構建了一種新型的符合納米材料的高靈敏的電化學免疫傳感器，結合了納米金具有獨特的電學以及良好的生物兼容性，很大的比表面積和很高的催化性能等性質以及石墨烯優異的導電性和較大的比表面積，制得了納米金-石墨烯復合的納米免疫傳感器。將這種納米免疫傳感器應用到對沙丁胺醇的檢測中，實驗表明其在1×10－6～5×10－3g/L范圍內呈良好的線性關系，并且具有超高的靈敏度，即檢測限為2×10－7g/L，同時對牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝等實際樣品進行了加標回收的實驗，也取得了滿意結果。實驗也表明，本實驗制備的納米免疫傳感器實現了對沙丁胺醇的檢測，同時對實際樣品也有很高的回收率。

[1]GABIOLA C, CALONGE M A G, PORTILLO M P, et al.Validation of a method for the determination of salbutamol in animal urine by gas chromatography-mass spectrometry and its application to treated lamb samples[J].Journel of Microcolumn Separations, 1996, 8: 361-364.

[2]ZHANG Yantu, ZHANG Zhujun, SUN Yonghua, et al.Development of an analytical method for the determination ofβ2-agonist residues in animal tissues by high-performance liquid chromatography with on-line electrogenerated [Cu(HIO6)2]5-luminol chemiluminescence detection[J].Journel of Agriculture and Food Chemistry, 2007, 55(13):4949-4956.

[3]WANG Huan, ZHANG Yong, LI He, et al.A silver-palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine, clenbuterol and salbutamol[J].Biosensors and Bioelectronics, 2013, 49: 14-19.

[4]VANOOSTHUYZE K E I, ARTSC J M, PETEGHEM C H V.Development of a fast and simple method for determination ofβ-agonists in urine by extraction on empore membranes and detection by a test strip immunoassay[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45: 3129-3137.

[5]SHELVER W L, SMITH D J.Determination of ractopamine in cattle and sheeo urine samples using an optical biosensor analysis:comparative study with HPLC and ELISA[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(13): 3721-3751.

[6]BRAMBILLA G, CENCI T, FRANCONI F, et al.A Loizzo Clinical and pharmacological profile in a clenbuterol epidemic poisoning of contaminated beef meat in Italy[J].Toxicology Letters, 2000, 114: 47-53.

[7]HU Lei, ZUO Peng, YE Bangce.Multicomponent meso fl uidic system for the detection of veterinary drug residues based on competitive immunoassay[J].Analytical Biochemistry, 2010, 405(1): 89-95.

[8]SHISHANI E, CHAI S, JAMOKHA S, et al.Determination of ractopamine in animal tissues by liquid chromatography- fl uorescence and liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Analytical Chimmica Acta, 2003, 483(1/2): 137-145.

[9]LI Cun, WU Yinliang, YANG Ting, et al.Simultaneous determination of clenbuterol, salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution[J].Journal of Chromatography A, 2010, 1217(50): 7873-7877.

[10]WANG Lian, LI Yuanqian, ZHOU Yunke, et al.Determination of four beta(2)- agonists in meat, liver and kidney by GC-MS with dual internal standards[J].Chromatographia, 2010, 71(7/8): 737-739.

[11]SHELVER W L, SMITH D J.Application of a monoclonal antibodybased enzyme-linkd immunosorbent assay for the dermination of ractopamine in incurred samples from food animals[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(10): 2742-2747.

[12]HE Limin, SU Yijuan, ZENG Zhenling, et al.Determination of ractopamine and clenbuterol in feeds by gas chromatography-mass spectrometry[J].Animal Feed Science and Technology, 2007, 132:316-323.

[13]FREDY M T, SALVADOR V L, ARTURO E M, et al.Application of high-performance liquid chromatographye-UV detection to quantification of clenbuterol in bovine liver samples[J].Journal of Food and Drug Analysis, 2013, 21: 414-420.

[14]BAZYLAK G, NAGELS L J.Simultaneous high-throughput determination of clenbuterol, ambroxol and bromhexine in pharmaceutical formulations by HPLC with potentiometric detection[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2003, 32(4/5): 887-903.

[15]BLANCA J, MUNOZ P, MORGADO M, et al.Determination of clenbuterol, ractopamine and zilpaterol in liver and urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta, 2005, 529: 199-205.

[16]SHEU S Y, LEI Y C, TAI Y T, et al.Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan[J].Analytica Chimica Acta, 2009, 654(2): 148-153.

[17]ZHANG Yan, GAO Xiang, GAO Aihua.A biotin-streptavidin amplified enzyme-linked immunosorbent assay with improved sensitivity for rapid detection of ractopamine in muscular tissue[J].Food Analytical Methods, 2012, 5(5): 1214-1220.

[18]陳鈺, 劉仲明, 王捷.納米材料在生物傳感器中的應用[J].醫療衛生裝備, 2009, 30(6): 31-33.

[19]蔣文, 袁若.納米材料在電化學生物傳感器及生物電分析領域中的應用[J].分析測試學報, 2011, 30(11): 1200-1206.

[20]WU Hai, FAN Suhua, ZHANG Wenbao.Amperometric immunosensor based on covalent immobilization of new methylene blue and penicillin polyclonal antibody for determination of penicillin G in milk[J].Analytical Methods, 2014, 6(2): 497-502.

[21]ZHU Ying, CAO Yaoyao, SUN Xia.Amperometric immunosensor for carbofuran detection based on MWCNTs/GS-PEI-Au and AuNPsantibody conjugatensors[J].Sensors, 2013, 13(4): 5286-5301.

[22]LI Shengxi, ZHANG Jiong, DENG Wangping.A highly sensitive amperometric immunosensor for clenbuterol detection in livestock urine[J].Electroanalysis, 2013, 25(4): 867-873.

[23]ZHANG Lingyan, LIU Yanjun.The signal-enhanced labelfree immunosensor based on assembly of prussian blue-SiO2nanocomposite for amperometric measurement of neuron-specific enolase[J].Analytica Chimica Acta, 2014, 806: 204-209.

[24]AMBROSI A, CASTA?EDA M T, KILLARD A J, et al.Doublecodi fied gold nanolabels for enhanced immunoanalysis[J].Analytical Chemistry, 2007, 79(14): 5232-5240.

[25]ZHANG Jingjing, CHENG Fangfang, ZHENG Tingting, et al.Design and implementation of electrochemical cytosensor for evaluation of cell surface carbohydrate and glycoprotein[J].Analytical Chemistry,2010, 82(9): 3547-3555.

[26]DAS J, AZIZ M A, YANG H.A nanocatalyst-based assay for proteins:DNA-free ultrasensitive electrochemical detection using catalytic reduction ofp-nitrophenol by gold-nanoparticle labels[J].Journal of the American Chemical Society, 2006, 128(50): 16022-16023.