手術法克隆豬胚胎移植研究

蒙小云 ，鄭 華 *，李 勇，夏代剛 ，竇紅偉 ，石 偉 ，田家寧

（1. 深圳市農牧實業(yè)有限公司，深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，深圳 518083）

本研究旨在優(yōu)化克隆豬胚胎移植技術，力求降低操作成本、提高效率和簡化操作，推進克隆豬試驗向產(chǎn)業(yè)化應用邁進。豬的克隆相對于牛羊等家畜難度大，直到2000年才獲得世界首例體細胞克隆豬。國內外已開展了不少克隆豬試驗，豬的克隆效率基本維持在1%～2%。胚胎移植成功率是影響克隆豬效率的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中所需材料包括：斷奶發(fā)情母豬、培育好的克隆胚胎數(shù)枚、無菌操作實驗室、手術臺、手術麻醉系統(tǒng)一套、手術刀、縫合針線等。要求試驗母豬單獨飼養(yǎng)，術前清潔并徹底消毒；移植的胚胎要求發(fā)育良好，嚴格按照恒溫38.5 ℃保存；手術前對手術室進行24 h紫外線照射處理；對手術人員手術前做好消毒凈化工作；手術所用的刀具、耗材做好消毒滅菌工作。確保胚胎移植過程處于無菌操作。

1.2 胚胎的建系及選擇

1.2.1 供體的選擇

在試驗開始前，根據(jù)公司種豬群育種數(shù)據(jù)，選擇遺傳指數(shù)高的，生產(chǎn)性能好的公豬作為此次試驗的供體。

1.2.2 體細胞采樣

保定好供體，采樣人員對供體耳緣周邊進行消毒清理，剃掉皮膚上層的絨毛，用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，裝入樣品管，放入專用冷凍箱保存。

1.2.3 胚胎建系

將采好的樣品送至深圳華大方舟生物技術有限公司進行胚胎建系。

1.2.4 胚胎選擇

建好胚胎系之后，胚胎挑選原則是盡量選取形態(tài)良好、擴張充分、內細胞團明顯的囊胚。

1.3 胚胎受體的選擇

胚胎受體的選擇主要關注以下幾方面：分娩過程長短正常、異常仔豬少、產(chǎn)后恢復快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬，同時選擇斷奶發(fā)情要在7 d以內的母豬，而且發(fā)情癥狀要很明顯。

1.4 移植時間

1.4.1 受體斷奶時間

在確定了手術移植時間后，反推母豬斷奶時間，即手術時間反推5 d為發(fā)情日期，發(fā)情日期反推6 d為斷奶日期。

1.4.2 移植胚胎發(fā)育日齡

經(jīng)過手工克隆出來的，發(fā)育6 d的胚胎。

1.5 手術前的準備工作

1.5.1 移植胚胎的準備

用專門的揀胚器對擬移植的胚胎進行分揀并裝入麥管，每頭受體母豬準備2個麥管，每個麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運輸箱。

1.5.2 受體母豬

對斷奶母豬進行斷奶后優(yōu)飼，確保受體母豬發(fā)情良好，發(fā)情后對受體母豬實行單欄飼養(yǎng)，術前做好清洗及消毒工作，手術前12 h禁食。

1.5.3 手術儀器準備和檢查

準備手術器械，紗布鍋，手術服，外科手術手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉。對所有進入手術室的器材都要進行滅菌處理。首先確定手術需要幾套滅菌器材，滅菌前用洗潔精清洗器材，然后通過高壓蒸汽鍋進行高壓高溫滅菌；高壓蒸汽鍋在103.4 kPa蒸汽壓下，溫度達到121.3 ℃，維持15～20 min，即可達到滅菌的效果；已滅菌的物品做好標記，與未滅菌的物品分開保存，以免弄錯。

1.6 克隆豬胚胎的移植手術

1.6.1 先期麻醉及固定

肌注受體母豬8～10 mL阿托品，抗痙攣，15 min后靜脈注射舒泰50，體重小于等于150 kg使用2～2.2 mL，大于150 kg使用2.2～2.8 mL。然后將受體母豬固定到手術架上；在手術過程中為了維持麻醉狀態(tài)，我們使用動物麻醉機來達到這個效果。動物麻醉機的原理是結合氧氣和笑氣的混合氣體以及揮發(fā)性異氟烷來維持麻醉作用。通過這種辦法使受體母豬在整個手術過程中處于麻醉狀態(tài)，方便了手術操作。

1.6.2 開腹手術

步驟1：鋪開洞巾，用4個持巾鉗固定于皮膚表面，避免夾到乳頭，影響后期泌乳。

步驟2:在倒數(shù)第2、 3個乳頭之間，用手術刀切開皮膚及皮下結締組織，準備止血紗布和止血鉗用以較小血管止血，提前準備非吸收性外科縫線，時刻準備對較大出血血管進行結扎。

步驟3：用止血鉗或手術刀沿腹白線進行分離脂肪層。

步驟4：分離脂肪層直至腹膜，切開腹膜。

步驟5：紗布攤開，上面噴灑一定量的生理鹽水，防止子宮脫水。

步驟6：從腹腔引出子宮，檢查卵巢的排卵情況，遇到排卵時間過早或過晚或子宮粘連嚴重的情況時，需放棄移植，更換受體。

步驟7：找到宮管結合處，用滅菌鈍性針頭扎一個小孔，整個過程要適時向子宮噴灑生理鹽水，保持子宮濕潤，不致脫水。

步驟8：用移植導管將胚胎緩慢輸入子宮角，然后用手指或止血鉗夾持小孔一段時間，防止出血。

步驟9：另一側子宮同上進行。

1.6.3 縫合

胚胎注射完畢后，需要對受體母豬進行術部縫合，具體步驟如下：

步驟1：止血紗布清除手術部位的血漬，將子宮還原入體內，在腹腔內加少量的生理鹽水清洗腹腔，在腹腔內灌入右旋糖酐50 mL和2:160萬單位青霉素。

步驟2：采用連續(xù)縫合法用吸收性外科縫線對腹膜進行縫合，縫合時，針間距不宜過大，過大會導致腸管露出腹腔發(fā)生疝氣，以小于1 cm為宜。

步驟3：同樣方法對肌肉層和脂肪層進行縫合，撒磺胺，進行消炎。

步驟4：用非吸收性縫線縫合皮膚層，采用結節(jié)性縫合。

步驟5：縫合完畢，用手術鑷將縫合部位皮膚外翻，便于愈合，手術鑷夾碘酊消毒手術部位。

步驟6：關掉麻醉罐，為保證麻醉動物安全，可繼續(xù)通氧氣，輔助呼吸一段時間。

1.7 術后管理及觀察

待受體母豬完全清醒后，單獨飼養(yǎng)管理，視傷口愈合情況決定是否需要相應治療。如恢復良好，按照配種后1個月母豬標準進行飼養(yǎng)管理，在28 d時通過B超進行查孕，確定受體是否懷孕。

2 結果與分析

2012年10月-12月，我們用手術法共開展16頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗（表1）。結果14頭手術法移植的母豬全部陸續(xù)返情，移植分娩率僅為12.5%（2/16），一窩產(chǎn)了3頭木乃伊，另一窩產(chǎn)了3頭活仔和1頭木乃伊，移植效果不理想。

2013年6月，我們根據(jù)手術法改進方案開展了8頭母豬的克隆豬胚胎移植試驗，此輪受體代孕母豬全部選用了長白經(jīng)產(chǎn)母豬，8頭豬分娩了4窩，其余4頭母豬返情。本輪手術法移植分娩率為50%（4/8），共分娩26頭活仔和4頭死胎，窩均分娩6.5頭活仔和1頭死胎，移植效果比較理想。

2013年6月根據(jù)改進方案手術移植的母豬有4頭過了一個情期沒有返情，而且用超聲波檢測已經(jīng)懷孕，堅定了我們對試驗成功的信心。于是，8月8日和8月18日我們又手術法移植了2頭母豬，結果分別于11月24日和12月5日分娩，分別分娩8頭和4頭活仔，分娩率達到了100%(2/2)，窩均分娩6頭活仔。

綜合2013年6—8月的手術法胚胎移植結果，10頭受體母豬合計分娩率達到60%（6/12），窩均分娩活仔6.33頭（38/6）。

3 討論

影響豬克隆試驗成敗的因素很多，吳蓉花等綜述了提高豬胚胎發(fā)育能力和克隆效率的研究進展。本試驗通過不斷摸索和總結，優(yōu)化了胚胎移植操作，逐步提高了胚胎移植成功率。主要的優(yōu)化措施包括：

表1 第1批手術法克隆豬胚胎移植試驗結果

表2 改良后手術法克隆豬胚胎移植試驗結果

2.1 胚胎建系的優(yōu)化

供體采樣時，樣本是否被污染，以及供體本身的年齡、健康狀況等因素對胚胎的建系和發(fā)育都有一定的影響，考慮到以上因素，在后面的供體采樣時我們分別嘗試了皮下脂肪采樣以及胎豬采樣，從建系的情況來看，明顯的優(yōu)于耳緣采樣。

根據(jù)之前采樣及移植情況來看，供體體細胞采樣受供體本身發(fā)育情況、體細胞分化及甲基化影響、樣本保存運輸情況等因素影響較大，結合這些情況我們通過采取30 d懷孕母豬的胚胎，作為體細胞提取樣本，能大大的優(yōu)化胚胎的建系成功率。

2.2 受體選擇的優(yōu)化

對有子宮炎癥，有子宮粘連、水腫、發(fā)育不理想等的受體母豬應放棄移植。由于我場兼顧生產(chǎn)，在選擇受體母豬時沒有太過嚴格地篩選，實驗個體水平參差不齊，這是導致第1批移植試驗成功率低的主要原因。從第2批胚胎移植開始，在選擇受體時，盡量選擇年齡適中、生命力旺盛、分娩時無異常產(chǎn)仔、子宮產(chǎn)后恢復良好、產(chǎn)房無發(fā)病情況、哺乳性能良好、斷奶發(fā)情時間準確、發(fā)情特征明顯的母豬。

2.3 手術操作的標準化

手術法開展胚胎移植，任何細微的不當操作都足以導致胚胎無法著床和死亡。本試驗通過摸索總結出了一套手術法克隆豬胚胎移植操作標準，雖然目前僅僅是企業(yè)標準，相信通過不斷修訂和完善，可逐步上升成行業(yè)標準。

2.4 術后管理的優(yōu)化

手術后，胚胎進入受體子宮內，能否著床及發(fā)育，這與受體子宮的內部環(huán)境、激素分泌、營養(yǎng)狀況以及疾病的影響是分不開的。術后對受體母豬的飼養(yǎng)管理應細致，注意觀察受體母豬手術恢復情況，有無被感染，是否需治療，母豬飼喂料量應根據(jù)母豬體況適當調整。細致的管理是保障克隆胚胎在子宮內著床及發(fā)育的關鍵因素。