響應面法優化纖維素酶輔助提取青蒿素的工藝研究

盧婉怡

[摘要] 目的 優化纖維素酶提高青蒿素提取率的反應條件。 方法 應用響應面實驗方法采用中心組合實驗設計研究酶反應過程中時間、加酶量、溫度對提取率的影響，并對提取工藝條件進行優化。 結果 纖維素酶輔助提取青蒿素的最優工藝條件：酶反應時間2.9 h，酶添加量0.20 g，反應溫度42.6℃。 結論 響應面試驗方法能夠有效提高纖維素酶輔助提取青蒿素的提取率。

[關鍵詞] 青蒿素；纖維素酶；提取；響應面

[中圖分類號] R94 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）01（a）-0004-03

青蒿素（Artemisinin）是從菊科植物黃花蒿（Art-emisia annua L.）的干燥地上部分提取分離得到[1]，因其含有過氧基團的倍半萜內酯結構，使其對瘧疾具有“高效、速效、低毒”的突出療效[2]，被世界衛生組織（WHO）稱為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。盡管青蒿素的化學合成、生物合成及組織培養相繼成功，但由于其產率低、成本高而難以投入工業化生產。青蒿素藥物的生產主要依靠從天然青蒿中提取[3]。工業化青蒿素提取方法中應用最廣的是常規有機溶劑提取法[4]，常用溶劑包括乙醇、溶劑汽油和石油醚等[5]。由于青蒿素在黃花蒿中含量低，常規有機溶劑提取法存在提取率低、耗時長、溶劑消耗大等問題[6]。近年來，一些用于天然產物提取的新技術不斷涌現，如微波、超聲波和酶技術等，取得了顯著成效。其中酶技術具有反應效率高、條件溫和、提取時間短、專一性強、易于控制和有效成分破壞少等優點[7]，是眾多研究的熱點。可用于輔助提取的酶的種類很多，纖維素酶是最常用的酶類之一，它能夠水解纖維素-1，4-糖苷鍵，破壞細胞壁的致密結構，從而提高提取率，因而在中草藥有效成分的分離提取方面取得了不少成果[8]。

我國是黃花蒿的主產國，資源豐富，植物提取青蒿素的產量占全球青蒿素產量的90%以上。將酶技術應用于青蒿素的提取過程，對提高青蒿素的提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究考察了纖維素酶輔助提取青蒿素的條件，利用響應面試驗分析酶反應過程各因素對提取率的影響，并優化酶輔助提取工藝，為纖維素酶在青蒿素提取工藝上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

FW135型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），752型紫外-可見分光光度計（上海菁華科學儀器有限公司）。

青蒿藥材購于廣州市清平中藥材市場，經本校張小紅講師鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經粉碎后過40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4[來源于綠色木霉（Trichoderma viride）]購自天野酶制劑（上海）有限公司，比活力40 000 U/g（按濾紙崩解力，天野法計算）。青蒿素標準品（百靈威科技有限公司，純度>98%）。無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸和乙酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法 稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.5），先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進行酶反應。酶反應結束后抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml無水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測定青蒿素含量。

1.2.2 青蒿素含量的測定方法 青蒿素僅在紫外區203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應后，生成一化合物Q292，該物質在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測[9]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組測定三個平行樣品，取平均值。根據標準曲線換算出青蒿素含量。

1.2.3 響應面實驗方法 響應面實驗是通過對響應面等值線的分析，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的一種統計方法。具有試驗次數少、精度高等優點；同時還能夠對各因子的交互作用進行評價，快速有效的確定最佳條件。其中包括多種設計方法，本研究利用Designexpert 7.0軟件進行設計實驗與分析，響應面實驗采用中心組合設計。中心組合設計試驗中每種因素取5種水平，以（-α、-1、0、1、α）編碼（本實驗中α=1.414）。本實驗選取酶反應時間（A）、酶反應溫度（B）和酶添加量（C）作為影響因素，中心組合實驗的編碼和水平見表1。

2 結果

2.1 青蒿素含量測定的標準曲線

精確稱取青蒿素標準樣品10 mg，溶于95%乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標準溶液。分別取標準溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%乙醇溶液至5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組取三個平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標，292 nm吸光值y為縱坐標作圖，結果得線性方程為D292=1.065c+0.019（r2=0.9971）。

2.2 響應面實驗結果

利用Designexpert 7.0軟件設計的中心組合實驗數n=12，實驗設計表及結果如表2所示，實驗次序為隨機安排。

對中心組合實驗的結果在Designexpert 7.0軟件中進行方差分析（ANOVA），結果表明，模型的P=0.0096，表明模型顯著。對因素的交互效應分析表明，A、C、BC和A2為顯著影響因素，即酶反應時間、加酶量、酶反應溫度與加酶量交互作用和反應時間的平方值為顯著影響因素。模型相關系數r2=0.9979，表明模型在99.79%程度上能夠解釋酶輔助提取率與變量之間的關系。模型的校正相關系數Adj r2=0.9882，與r2的數值相接近表明模型預測值和實際實驗結果具有良好的相關性。模型的變異系數（coefficient of variation，CV）為2.58%，表明模型的可信任程度高。

由實驗結果分析導出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預測最大值為3.24，此時酶反應時間為2.94 h，酶反應溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預測值進行驗證，取酶反應時間2.9 h，酶反應溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預測值基本吻合，表明優化模型能夠很好地說明酶反應各因素與提取率之間的關系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當地利用纖維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細胞壁反應的主要因素包括酶用量、酶反應溫度和酶反應時間等[10]，本研究利用響應面實驗進行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進行優化，優化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術在中藥制藥領域的研究和應用提供了參考。

[參考文獻]

[1] 張鳳杰，劉祝祥，陳功錫.青蒿藥用成分提取方法及檢測技術研究進展[J].吉首大學學報（自然科學版），2010，31（4）：103-107.

[2] 夏錚錚.青蒿藥材及青蒿素系列藥物的含量測定方法研究[D].重慶：重慶醫科大學，2006.

[3] 李子穎，李士雨，齊向娟.青蒿素提取技術研究進展[J].中藥研究與信息，2002，4（2）：17-21.

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[6] 錢國平.黃花蒿中提取與純化青蒿素的研究[D].杭州：浙江大學，2007.

[7] 張圣燕.纖維素酶在天然產物提取中的應用研究[J].廣東化工，2011，38（9）：59-60.

[8] 張巾英，張明春.應用纖維素酶提取中草藥有效成分的研究進展[J].上海中醫藥雜志，2007，41（1）：79-81.

[9] 李春莉，王莎莉，王亞平，等.紫外分光光度法測定青蒿素的含量[J].重慶醫科大學學報，2007，32（4）：413-415.

[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）

由實驗結果分析導出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預測最大值為3.24，此時酶反應時間為2.94 h，酶反應溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預測值進行驗證，取酶反應時間2.9 h，酶反應溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預測值基本吻合，表明優化模型能夠很好地說明酶反應各因素與提取率之間的關系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當地利用纖維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細胞壁反應的主要因素包括酶用量、酶反應溫度和酶反應時間等[10]，本研究利用響應面實驗進行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進行優化，優化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術在中藥制藥領域的研究和應用提供了參考。

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[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）

由實驗結果分析導出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預測最大值為3.24，此時酶反應時間為2.94 h，酶反應溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預測值進行驗證，取酶反應時間2.9 h，酶反應溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預測值基本吻合，表明優化模型能夠很好地說明酶反應各因素與提取率之間的關系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當地利用纖維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細胞壁反應的主要因素包括酶用量、酶反應溫度和酶反應時間等[10]，本研究利用響應面實驗進行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進行優化，優化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術在中藥制藥領域的研究和應用提供了參考。

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[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）