去脂軟肝方對(duì)高脂誘導(dǎo)大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實(shí)驗(yàn)研究

卞瑤等

[摘要] 目的 探討去脂軟肝方對(duì)高脂誘導(dǎo)脂肪肝大鼠肝組織血管性血友病因子的影響作用。 方法 高脂飲食復(fù)制大鼠脂肪肝模型，將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為三組：正常組，模型組，去脂軟肝方組。去脂軟肝方組予去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g）共12周；HE染色觀察肝臟脂肪變性情況；測(cè)定大鼠血清血脂、肝脂、血漿血小板聚集率及肝組織血管性血友病因子（vWF）。 結(jié)果 12周末模型組大鼠血脂[血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；去脂軟肝方組血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)水平比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；模型組大鼠肝臟組織中vWF比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織vWF比模型組低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 去脂軟肝方能明顯改善高脂誘導(dǎo)脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性。減少vWF分泌、抑制血小板聚集、減輕血管及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是其作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 去脂軟肝方；高脂；脂肪肝；大鼠；血管性血友病因子

[中圖分類號(hào)] R575.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（a）-0004-03

近年來(lái)，隨著社會(huì)的發(fā)展，生活水平提高，我國(guó)患脂肪肝人群數(shù)量逐年遞增，部分脂肪肝如果遷延不愈，可進(jìn)展為肝纖維化甚至肝硬化[1]。因此，如何在早期阻止脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展是目前研究的關(guān)鍵。課題組前期對(duì)云南省榮譽(yù)名中醫(yī)、著名中西醫(yī)結(jié)合肝病專家蘇漣教授以“辨病為主，從瘀而治”思路擬定的“去脂軟肝方”進(jìn)行研究，證實(shí)該方具有較好的改善高脂誘導(dǎo)脂肪肝血脂、肝脂肝及肝組織脂肪變性作用[2-6]。但其作用機(jī)制及關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚不完全清楚。本研究采用高脂誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠，觀察脂肪肝大鼠模型與血瘀證、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）關(guān)系，探討去脂軟肝方治療脂肪肝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠30只，體重（100±10）g，清潔級(jí)。購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK（川）2010-16，云南中醫(yī)學(xué)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）動(dòng)物房飼養(yǎng)，造模及觀察。

1.2 藥品及主要試劑

去脂軟肝方三七1 g、山楂15 g、菊花10 g、白術(shù)15 g、青皮6 g、莪術(shù)15 g等七味中藥）購(gòu)自我院門診部藥房，由我院中藥制劑室制成流浸膏（含生藥1.44 g/mL）；膽固醇（Cholesterol）分析純，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬油，購(gòu)自昆明沃爾瑪超市，生產(chǎn)日期：20110326；大鼠vWF ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司），批號(hào)20110401A：購(gòu)自昆明晨綠生物科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 造模方法

將大鼠分為正常組10只，高脂飲食造模組20只，正常組大鼠每天予以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠每天予以高脂飼料（88%普通飼料基礎(chǔ)上加10%豬油，2%膽固醇）喂養(yǎng)，連續(xù)12周，均自由飲水。

1.4 分組及給藥

自造模之日起，高脂飲食造模組20只，隨機(jī)分為模型組10只和去脂軟肝方組10只；正常組和模型組給予生理鹽水灌胃（1 mL/200 g，每日），去脂軟肝方組按去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g，每日），連續(xù)12周。

1.5 觀察指標(biāo)

①HE染色光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化；②血脂[血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]、肝脂檢測(cè)（肝臟TC、TG）；③血漿血小板聚集率檢測(cè)、肝組織vWF檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織HE染色

HE染色顯示正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，胞圓形，呈條索狀排列，可見(jiàn)中央靜脈。模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見(jiàn)超過(guò)2/3的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細(xì)胞核擠向胞膜下，可見(jiàn)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明（胞漿疏松化），嚴(yán)重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變）；去脂軟肝方組可見(jiàn)一定量的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡。

2.2 去脂軟肝方對(duì)高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)變化的影響

模型組大鼠血脂（血清TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；去脂軟肝方組血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 去脂軟肝方對(duì)高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子的影響

模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；模型組大鼠肝臟組織中血管性血友病因子比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子比模型組低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

本研究采用改良高脂飼料即88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇復(fù)制大鼠脂肪肝模型，12周末HE染色顯示模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見(jiàn)超過(guò)2/3的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細(xì)胞核擠向胞膜下，可見(jiàn)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明（胞漿疏松化），嚴(yán)重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變），同時(shí)，大鼠血清與肝組織勻漿檢測(cè)TC、TG均有不同程度的增高，出現(xiàn)典型脂肪肝大鼠模型。

目前脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究表明脂肪肝患者大多存在高血脂及微循環(huán)障礙的改變[6]，一方面血脂升高、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇能夠促進(jìn)血小板高聚集率，發(fā)生血小板活化[7-8]；另一方面血小板活化，進(jìn)一步引起血液高凝狀態(tài)的出現(xiàn)，血液黏度增高，血液循環(huán)阻力升高，加重微循環(huán)障礙，從而加重血管內(nèi)皮損傷、肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致脂肪肝病變發(fā)展。

vWF是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的重要標(biāo)志物，通過(guò)測(cè)定vWF的水平可以判定患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的慢性或急性階段[9]。vWF是介導(dǎo)血小板與血管內(nèi)皮下組織黏附的主要分子，目前已知它能參與血小板-血管壁，血小板-血小板之間的相互作用，在血小板活化、血液凝固中發(fā)揮重要作用[10]，有研究表明，vWF在肝臟損傷和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮積極作用，肝組織中vWF可沿肝竇的表達(dá)使肝竇內(nèi)血流處于血栓前狀態(tài)，易于形成微血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，肝臟微循環(huán)障礙可以影響相應(yīng)供血區(qū)域肝細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀況，造成肝細(xì)胞缺血缺氧[11]。有學(xué)者也認(rèn)為vWF升高與肝臟血管內(nèi)皮損害程度成正比，可以作為反映肝臟血管內(nèi)皮損害的一個(gè)非特異性指標(biāo)[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，12周末模型大鼠血清與肝組織勻漿檢測(cè)TC、TG均有不同程度的增高的同時(shí)，血漿血小板聚集率升高，肝組織vWF分泌增多，且與正常組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明肝組織vWF因子分泌增多，血小板聚集率增加，發(fā)生血小板活化，加重微循環(huán)障礙，從而影響到肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）。表明脂肪肝模型大鼠與vWF、血小板聚集率、血小板活化及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間有一定關(guān)聯(lián)。

云南著名中西醫(yī)結(jié)合肝病專家蘇漣教授對(duì)早期脂肪肝提出“肝郁脾虛，虛瘀交結(jié)”病理特點(diǎn)，并從多年臨床用藥經(jīng)驗(yàn)中，反復(fù)篩選組成以三七、莪術(shù)、赤芍等活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”方藥治療脂肪肝取得明顯的臨床療效。從脂質(zhì)代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行多項(xiàng)藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)高脂飼料所致的高血脂、肝脂有降低作用，同時(shí)還能明顯降低停飼高脂飼料后大鼠的肝脂、血脂水平，表明其不僅能抑制脂質(zhì)的吸收，還能促進(jìn)脂質(zhì)的降解。本研究與以往研究結(jié)果相一致[2-6]。因此脂肪肝的中醫(yī)治療從瘀而治，有臨床及藥理研究的支持，血小板活化是血瘀證產(chǎn)生的重要病理生理基礎(chǔ)，運(yùn)用活血化瘀為主方藥可以抑制血小板聚集，減少血小板活化，從而改善肝臟微循環(huán)障礙，減輕脂肪肝病變發(fā)展。本研究結(jié)果表明以活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”可能是通過(guò)減少vWF分泌抑制血小板聚集，減少血小板活化，減輕血管及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 范建高.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，（5）：641-644.

[2] 林青，張超，游澤溥，等.去脂軟肝散對(duì)小鼠血脂的影響[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2000，21（6）：30.

[3] 孫創(chuàng)斌，張超.去脂軟肝丸對(duì)四環(huán)素致小鼠脂肪肝模型肝脂的影響[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，25（1）：8-10.

[4] 林青，張超.去脂軟肝丸治療脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2002，9（3）：140-141.

[5] 林青，張超，李立紀(jì)，等.去脂軟肝丸治療脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2002，9（3）：140.

[6] 孫創(chuàng)斌，李萍.去脂軟肝丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂肪性肝炎的保護(hù)作用[J].中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2003，（79）：1-2.

[7] 李松梅，李秀芳，林青，等.參苓白術(shù)散和膈下逐瘀湯對(duì)早期脂肪肝大鼠模型血小板聚集的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（5）：38-39.

[8] 范建高，鄭曉英，張梅，等.非酒精性脂肪性肝病大鼠肝竇超微結(jié)構(gòu)及微血栓觀察[J].肝臟，2005，10（1）：41-42.

[9] 劉嵩，盧笑叢，葛建，等.高脂所致脂肪肝動(dòng)物模型建立的動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（11）：1399-1402.

[10] 張杏泉，王少東，范清宇，等.組織型纖溶酶原激活物基因療法防治血管吻合口血栓栓塞[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22：356-358.

[11] 胡濱，林秀英.黃智銘.血漿血管性假血友病因子對(duì)肝纖維化的診斷價(jià)值[J].中國(guó)綜合臨床，2001，17：402-403.

[12] Bamch Y，Neubaue TK，Ritzel A，et al. Vonwi Uebrand gene expression in damaged human liver [J]. Hepatogroenterology，2004，51：684-688.

[13] 范宗滂，蔡慧芬，施云松.病毒性肝炎血漿血管性假血友病因子的檢測(cè)及其臨床意義[J].中華傳染病雜志，1989， 7：46-48.

（收稿日期：2013-09-03 本文編輯：張瑜杰）