木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠神經細胞凋亡及HSP70 mRNA、Fas mRNA表達的影響

劉濤　張俊會　李娜

[摘要] 目的 探討木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠神經細胞凋亡及HSP70 mRNA、Fas mRNA表達的影響。 方法 Wistar大鼠60例，隨機分為對照組、模型組及木犀草素高、中、低劑量組。對照組給予常規飼料喂養；模型組及木犀草素高、中、低劑量組采用高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲霉素建立糖尿病大鼠模型，造模后，木犀草素高劑量、中劑量、低劑量組每日分別給予木犀草素200、100、50 mg/kg灌胃，模型組每日給予生理鹽水2 mL灌胃，連續8周。再以線栓法建立大鼠大腦中動脈永久性缺血模型，術后24 h斷頭取腦，用TUNEL法和原位雜交法觀察大鼠腦細胞凋亡與腦組織HSP70 mRNA及Fas mRNA的表達。 結果 木犀草素低、中、高劑量組糖尿病腦梗死神經細胞凋亡數分別為（16.42±1.39）、（11.08±2.15）、（9.25±1.98）個/高倍視野低于模型組[（29.75±2.36）個/高倍視野]，組間差異有統計學意義（均P < 0.01）；HSP70 mRNA在模型組表達[（9.75±2.766）個/高倍視野]顯著高于對照組[（0個/高倍視野）]（P < 0.01）；低、中、高三個劑量的木犀草素組HSP70 mRNA表達分別為（11.33±2.15）、（13.92±2.15）、（14.92±1.95）個/高倍視野，均高于模型組[（9.75±2.76）個/高倍視野]（均P < 0.01）；Fas mRNA在模型組大鼠腦組織陽性細胞數[（25.33±3.17）個/高倍視野]顯著高于對照組[（2.67±0.95）個/高倍視野]（P < 0.01）；高、中、低劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細胞數分別為（11.92±2.41）、（12.00±2.50）、（19.75±2.54）個/高倍視野，顯著低于模型組[（25.33±3.17）個/高倍視野]（均P < 0.01）。 結論 木犀草素可以抑制糖尿病腦梗死大鼠神經細胞凋亡，其機制與木犀草素升高大鼠腦組織HSP70 mRNA表達，同時使Fas mRNA的表達降低有關。

[關鍵詞] 糖尿病；腦梗死；木犀草素；HSP70 mRNA；Fas mRNA

[中圖分類號] R743.32 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（a）-0021-03

缺血性腦損傷后會出現多種病理改變，壞死是引起梗死中心區神經細胞死亡的主要原因，而凋亡則是導致梗死半暗帶區神經細胞死亡的主要因素[1]。凋亡細胞主要存在于半暗帶區，因而凋亡能夠影響最后腦梗死的面積[2]。HSP70是一種細胞內源性保護蛋白，主要參與機體耐受的形成[3-4]，有抑制細胞凋亡的作用，而Fas基因是促進細胞凋亡的重要基因[5-6]。木犀草素（Luteolin）最初是從草本植物木犀草的葉、莖、枝中被分離出而得名，其具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗過敏、抗腫瘤等多種生物學作用。為此，本實驗在于觀察木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠神經細胞凋亡及HSP70 mRNA、Fas mRNA表達的影響，以探討木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和藥品

雄性Wistar大鼠60只，體重180～230 g。來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證：SCXK（京）2009-0003。細胞凋亡檢測試劑盒（TUNEL）、HSP70及Fas原位雜交試劑盒均購于武漢博士德生物技術公司；木犀草素（98%）購于陜西慧科植物開發有限公司；鏈尿菌素（STZ）購于Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制作 各組均先以高脂高糖飼料喂養4周，然后以STZ（30 mg/kg）腹腔注射1次，72 h后尾靜脈采血測定血糖，空腹血糖> 16.7 mol/L的大鼠判定為造模成功。以線栓法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞（MCAO）模型[7]。大鼠成功麻醉后，頸部正中切口，暴露并鈍性游離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈及頸內動脈，結扎同側CCA近心端和頸外動脈（ECA）分叉部，距頸總動脈分叉處近心端5 mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產尼龍線插入頸內動脈，以頸總動脈分叉處計算進線深度為18 mm左右，至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供，結扎頸內動脈并固定魚線。術中，用加熱墊和燈泡保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.2.2 動物分組及處理 60只Wistar大鼠，隨機分為5組：對照組、模型組及木犀草素高、中、低劑量組，每組各12只。糖尿病性動物模型制備后，開始灌胃給藥，木犀草素高劑量、中劑量、低劑量組每日分別給予木犀草素200、100、50 mg/kg灌胃，模型組與對照組每日給予生理鹽水2 mL灌胃，連續8周。每組大鼠于MCAO術后24 h斷頭取腦，用TUNEL法和原位雜交法觀察大鼠腦細胞凋亡與腦組織HSP70 mRNA及Fas mRNA的表達。

1.2.3 原位凋亡細胞檢測 各實驗組大鼠斷頭取腦后，將腦組織置于4%的多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，做連續切片，切片厚度為5 μm。TUNEL染色按試劑盒說明操作，細胞核中有棕褐色顆粒者為TUNEL陽性細胞，細胞計數于高倍鏡（40×10）下隨機選取5個視野，計數陽性細胞數，取平均值。

1.2.4 HSP70 mRNA及Fas mRNA測定 采用原位雜交法，操作步驟嚴格按照說明書進行，DAB顯色蘇木素復染。陽性判斷標準：HSP70 mRNA及Fas mRNA表達于細胞漿，以棕黃色顆粒為陽性。以高倍鏡（40×10）觀察5個視野，計數陽性細胞數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，各組間比較采用方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織中凋亡細胞數

TUNEL陽性細胞分布在腦梗死半暗帶區，形態學上表現為胞核固縮，呈棕褐色。本實驗中對照組無凋亡細胞，模型組凋亡細胞數顯著高于對照組（P < 0.01）；木犀草素高、中、低劑量三組凋亡細胞數均低于模型組，組間差異有統計學意義（均P < 0.01）；木犀草素三組中隨藥物劑量加大凋亡細胞數逐漸減少，高、中劑量組及中、低劑量組間差異有統計學意義（均P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠腦組織中HSP70 mRNA、Fas mRNA的表達

對照組HSP70 mRNA無表達，模型組HSP70 mRNA的表達顯著高于對照組（P < 0.01）；低、中、高三個劑量的木犀草素組HSP70 mRNA表達均高于模型組（均P < 0.01）。高、中劑量木犀草素組之間及中、低劑量劑量木犀草素組之間比較差異均有統計學意義（均P < 0.01）。Fas mRNA在模型組大鼠腦組織陽性表達高于對照組，組間差異有統計學意義（P < 0.01）；高、中、低劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細胞數顯著低于模型組（均P < 0.01）；高、中劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細胞數顯著低于小劑量木犀草素組（均P < 0.01）。見表1。

3 討論

腦梗死后亞急性期和慢性期病變進一步加重的重要原因之一是神經元遲發性死亡，急性腦缺血缺氧損傷后繼發的細胞凋亡是遲發性神經元死亡的主要方式[8-9]。細胞凋亡不同于細胞壞死，又稱為程序性死亡，是機體清除衰老和損傷的細胞以保持內環境平衡的一種自我調節機制。腦缺血后，缺血中心區神經元細胞因為完全缺血而發生不可逆轉地死亡，缺血周邊區尤其是缺血半暗帶內因多種病理因素而激活凋亡通路，使細胞呈現凋亡的形態學改變。因此挽救半暗帶內受損的神經元，對治療缺血性腦血管疾病就顯得尤為重要。細胞凋亡受一系列基因的調控，HSP70與Fas基因是與細胞凋亡有關的兩個重要基因。HSP70在正常大鼠腦內并不存在，但在腦缺血、缺氧等誘導下其表達增加，HSP70的高表達是腦受到保護的標志[10]。而Fas基因是重要的促凋亡因子。本實驗發現對照組大鼠腦內無HSP70 mRNA陽性細胞，表明在正常情況下腦內無HSP70 mRNA的表達。在糖尿病腦梗死模型組大鼠腦組織中HSP70 mRNA表達增強，與對照組比較差異有統計學意義；對照組大鼠腦內有少數Fas mRNA陽性細胞，在模型組大鼠腦組織中Fas mRNA表達增強，與對照組比較差異有統計學意義。

神經細胞凋亡是一遲發性病變，因而尋求抑制腦缺血后神經元過度凋亡的有效藥物是實現腦缺血后腦保護的一條重要途徑。木犀草素是存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有包括抗凋亡在內的多種生物作用。已有研究證明，木犀草素對大鼠早期糖尿病心肌病及實驗性糖尿病大鼠的腎臟有保護作用[11-14]。本實驗結果顯示低、中、高劑量木犀草素組HSP70 mRNA陽性細胞數明顯高于模型組；而三種劑量的木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細胞數顯著低于模型組；同時該實驗凋亡細胞數檢測顯示，模型組凋亡細胞數顯著高于對照組；木犀草素高、中、低劑量三組凋亡細胞數均低于模型組，組間差異有統計學意義；木犀草素三組中隨藥物劑量加大凋亡細胞數逐漸減少，顯示有劑量依賴性。此結果提示木犀草素可增強HSP70 mRNA的表達，同時使Fas mRNA的表達減少，從而抑制腦缺血后神經細胞凋亡，達到對糖尿病腦梗死的腦組織的保護作用。

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（收稿日期：2013-10-17 本文編輯：衛 軻）