響應面法優化葡萄醋發酵條件的研究

王璐，閻曉菲，李艷云，李曉鵬，梁旭，宰雪平，古麗娜孜，武運*

響應面法優化葡萄醋發酵條件的研究

王璐1，閻曉菲2，李艷云2，李曉鵬2，梁旭2，宰雪平2，古麗娜孜1，武運1*

果醋一般是以次果和果品加工的下腳料為原料，經現代生物技術釀制而成[1-3]。葡萄醋是以葡萄為主要發酵原料釀造的一種營養豐富、風味優良的酸味調味品。不僅具有增進食欲、促進消化、保護皮膚、解除疲勞等優點，還具有相應原料的保健功能，已成為新一代的健康飲品[4-8]。葡萄醋起源于歐洲，是歐美食醋中的最優品種，在法國、意大利、西班牙等葡萄酒釀造大國，葡萄醋也十分盛行[9]。我國的糧食釀造醋及果醋的品種繁多，但葡萄醋與國外相比品種開發較少，并且缺乏高品質的葡萄醋。

隨著市場需求量增大以及農業產業結構的調整，新疆赤霞珠葡萄種植面積逐年擴大，成為新疆釀酒葡萄第一主栽品種，一定程度上帶動了新疆經濟的發展。現階段，赤霞珠主要是以葡萄原酒的形式出售，缺少特色，附加值低；如果能利用赤霞珠葡萄發酵成葡萄醋飲品出售，不僅可增加飲料的品種，并且可以減少在貯藏過程中因變質而造成的浪費，還可提高新疆赤霞珠葡萄的綜合經濟效益。

本研究以新疆地產新鮮釀酒葡萄赤霞珠為原料，將其清洗、破碎后經酒精發酵、醋酸發酵釀制葡萄紅醋，通過響應面法對醋酸發酵條件進行優化，旨在研究適合于赤霞珠葡萄醋的醋酸發酵條件，為工業化、機械化生產葡萄醋提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠：新疆阜康市釀酒葡萄園區。

酵母菌、醋酸菌：新疆農業大學食品科學與藥學學院食品微生物實驗室提供。

檸檬酸：天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉：天津市光復科技發展有限公司；無水乙醇：天津市致遠化學試劑有限公司；酚酞：天津基準化學試劑有限公司；果膠酶：南寧龐博生物工程有限公司；亞硫酸鈉：天津市富通化工有限公司。

醋酸菌培養基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣，配制固體培養基加入2%瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，配制固體培養基加入2%瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHP-781型電熱恒溫培養箱：湖北省黃石市醫療器械廠；LHS-150SC恒溫恒濕箱、THI-98A恒溫振蕩箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1Cu型雙人單面凈化工作臺：蘇州進化設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋、SXKW數顯控溫電熱套：北京市永光明醫療儀器廠；YBFJ110酒精計：冀州市耀華器械儀表廠；WFI-J型手持測糖儀：成都豪創光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

原料處理：剔除腐爛變質的葡萄顆粒，選擇新鮮、顆粒飽滿的赤霞珠葡萄。

破碎：使用打漿機對原料進行破碎，加入H2SO3100 mg/L[10]。

酶解：加入一定量的果膠酶，在35℃酶解3 h，提高果汁產量，縮短加工時間[11]。

調節果汁：使用蔗糖將糖度調至18°Bx，用檸檬酸和NaOH調節酸度至pH 3.5～4.0[12]。

種子發酵液：將4℃條件下保存的酵母菌與醋酸菌菌種在無菌環境中接種于YPD培養基和醋酸培養基中活化，分別置于28～32℃培養48 h，以備后期使用。

母發酵液：將預處理好的葡萄汁分裝于三角瓶中，在無菌條件下，將已活化好的酵母菌與醋酸菌種子發酵液按5%接種量接入三角瓶中，搖勻，分別置于28～32℃培養48h，以備后期使用。

酒精發酵：將6%酵母菌母發酵液加入葡萄汁中，31℃發酵6 d，得到酒精度為11.5%vol的酒精發酵液。

醋酸發酵：將醋酸菌母發酵液按一定量加入發酵液中，在適宜的條件下進行發酵。

澄清：將發酵產品于2500r/min離心10min，取上清液。滅菌：采用巴氏殺菌法，75℃殺菌15～20 min。

1.3.3 葡萄醋發酵單因素試驗

分別選取醋酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發酵溫度（24℃、26℃、28℃、30℃、32℃）、發酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）三個因素進行醋酸發酵單因素試驗，并對醋酸發酵液進行酸度的測定。

1.3.4 葡萄醋發酵響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken Design設計原理，以酸度為響應值（Y），接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為影響因素，利用響應面軟件Design-Expert 8.05軟件進行響應面試驗。響應面試驗的因素和水平編碼值如表1所示。

表1 響應面試驗的因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 測定方法

酸度測定：參照國標GB/T 12293—90《水果、蔬菜制品可滴定酸度的測定》中的酸堿中和滴定法；酒精度測定采用GB/T15038—2006《葡糖酒、果酒通用試驗方法》中的酒精蒸餾法；可溶性固形物測定：手持糖度計；殘糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法；菌落總數、大腸菌群測定采用GB/T 4789.3—2008《食品衛生微生物學檢驗》中的方法。

2 結果與分析

2.1 醋酸發酵單因素試驗結果

2.1.1 接種量對醋酸發酵的影響

將酒精發酵液的酒精度調整為11%vol，分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種醋酸菌母發酵液，30℃培養6 d，每隔1 d取樣測定發酵液酸度，結果見圖1。

圖1 接種量對醋酸發酵液酸度的影響Fig.1 Effect of inoculum on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖1可看出，不同的醋酸菌接菌量對發酵液酸度的影響很大。隨著接種量的增大，發酵速度和產酸量也相應提高，但當接種量過大（達到8%～10%）時，發酵液中的營養物質在發酵前期過多的用于醋酸菌細胞的增值上，發酵前3d酸度高于其他接種量，而在發酵第4～6天，由于發酵底物減少，酸度增加量較少；當接種量為6%發酵第6天時，發酵液酸度最高為5.5 g/100mL。綜上所述，選取4%、6%、8%作為響應面取值范圍。

2.1.2 溫度對醋酸發酵的影響

將酒精發酵液的酒精度調整為11%vol，接種6%醋酸菌母發酵液，分別以24℃、26℃、28℃、30℃、32℃的發酵溫度培養6 d，每隔1 d取樣測定發酵液酸度，結果見圖2。

圖2 發酵溫度對發酵液酸度的影響Fig.2 Effect of temperature on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖2可看出，發酵溫度會直接影響醋酸菌的繁殖速度和產酸速度，若發酵溫度過低會導致發酵速度緩慢，產酸量低；若發酵溫度過高，則會造成醋酸菌提前老化，使酒精轉化率變低[7]。在試驗范圍內，發酵第2天不同發酵溫度的酸度差異較小，隨著發酵時間的延長變化趨于明顯，28℃的醋酸發酵液酸度比其他發酵液酸度高，28℃發酵液在第6天時的酸度為5.3 g/100mL，綜上所述，選取26℃、28℃、30℃作為響應面取值范圍。

2.1.3 發酵時間對醋酸發酵的影響

將酒精發酵液的酒精度調整為11%vol，接種6%醋酸菌母發酵液，28℃條件下培養至第10天，從第2天開始，每隔1 d取樣測定發酵液酸度，結果見圖3。

圖3 發酵時間對發酵液酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖3所示，當發酵時間在第2～6天時，酸度增加量明顯，變化趨勢較大，發酵到第6天時酸度達到5.5 g/100mL，在發酵第7～10天，隨著發酵時間的增長酸度變化趨于平緩，酸度變化量較小。綜上所述，選取第5天、第6天、第7天作為響應面取值范圍。

2.2 赤霞珠葡萄紅醋醋酸發酵響應面優化結果

2.2.1 響應面優化分析

綜合單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.05進行分析，試驗結果和方差分析分別見表2和表3。

表2 響應面試驗及響應值Table 2 Experimental design and corresponding response value

按照表2試驗數據進行多元回歸方程擬合，可建立以醋酸發酵液酸度對接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）的擬合方程為：

表3 響應面試驗結果及方差分析Table 3 Results and variance analysis of response surface experiment

響應面回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性，由P值來判定，P值越小，則相對應變量的顯著程度越高[13]。由表3可知，當模型F=25.28時，P=0.000 2＜0.01，說明模型是極顯著的。當失擬項F=0.052時，P=0.982 0＞0.05，說明模型失擬項不顯著，由此可以說明模型建立呈顯著性。決定系數R2=0.970 2，校正系數R2Adj=0.931 8，表明醋酸發酵液中酸度的實測值與預測值之間具有良好的擬合度，試驗操作準確可信，可以利用此模型對赤霞珠紅醋醋酸發酵過程進行分析和預測。

從表3可以看出，一次項與交互項AB表現出顯著水平，二次項和交互項AC、BC對赤霞珠紅醋的Y值影響表現出極顯著水平。試驗結果可以得出各因素對赤霞珠紅醋酸酸度的影響順序為A＞C＞B，接種量＞發酵時間＞發酵溫度。

2.2.2 響應面圖與等高線圖分析[14-15]

各因素對醋酸發酵液酸度的影響和各因素之間的交互作用見圖4。從圖4可以看出，隨著接種量的增大，發酵溫度呈現先增大后減小的趨勢；隨著發酵時間的延長，接種量呈現先增大后減小的趨勢；隨著發酵溫度的升高，發酵時間呈現先增大后減小的趨勢。

圖4 各因素相互作用對赤霞珠葡萄醋酸發酵酸度影響的響應面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour line of effect of interaction between every two factors on acidity of Cabernet Sauvignon acetic acid fermentation

通過Design-Expert 8.05軟件，根據所建立的數學模型進行參數的最優化分析，可得出醋酸發酵液的最佳發酵條件為接種量6.42%、發酵溫度27.97℃、發酵時間5.78 d，在此條件下醋酸發酵液酸度可達5.79 g/100 mL。

2.2.3 驗證試驗

為檢驗該法可靠性，采用上述優化條件進行驗證試驗，同時考慮實際操作的方便，將發酵工藝參數修正為接種量6%、發酵溫度28℃、發酵時間6 d，經過3組平行試驗，最終得到的酸度平均值為5.82 g/100 mL，與理論值相對誤差差值較小，可見該模型準確可靠，利用該模型在實踐中進行預測是可行的，具有一定的實用價值。

2.3 產品質量指標檢測結果

感官評指標、理化指標符合國標GB 18187—2000《中華人民共和國釀造食醋國家標準》的要求；微生物指標符合國標GB2719—2003《中華人民共和國釀造食醋衛生國家標準》的要求。

3 結論

在單因素試驗基礎上，利用響應面軟件，對赤霞珠葡萄紅醋醋酸發酵條件進行模型建立和模型預測，得出最佳醋酸發酵條件為接種量為6%，發酵溫度為28℃，發酵時間為6 d，最終得到的酸度為5.82 g/100 mL。

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（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊830052）

為探究赤霞珠葡萄醋醋酸發酵規律，以新疆特色赤霞珠葡萄為原材料，采用響應面法對赤霞珠葡萄紅醋醋酸發酵的發酵條件（接種量、發酵溫度、發酵時間）進行優化。優化得到最佳發酵條件為醋酸菌接種量6%，發酵溫度為28℃，發酵時間為6 d，發酵得到赤霞珠葡萄醋總酸可達到5.79 g/100 mL。

赤霞珠；葡萄醋；響應面分析；醋酸發酵

Optimization of grape vinegar fermentation conditions by response surface methodology

WANG Lu1,YAN Xiaofei2,LI Yanyun2,LI Xiaopeng2,LIANG Xu2,ZAI Xueping2,GU Linazi1,WU Yun1*
(1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.College of Science and Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

In order to explore Cabernet Sauvignon grape acetic fermentation law,using Cabernet Sauvignon grapes in Xinjiang area as raw material, the fermentation conditions(inoculum,fermentation temperature and fermentation time)was optimized by response surface methodology.Result showed that the optimized conditions were as follows:acetic acid bacteria inoculum 6%,fermentation temperature 28℃,fermentation time 6 d,under the condition,the total acidity of the Cabernet Sauvignon vinegar was 5.79 g/100mL.

Cabernet Sauvignon;grape vinegar;response surface analysis;acetic fermentation

TS255.47

A

0254-5071（2014）07-0055-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.012

2014-04-28

新疆維吾爾自治區科技計劃項目（201431113）；新疆農業大學科學技術學院大學生創新項目（2013kcx01）

王璐（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：武運（1965-），教授，碩士，研究方向為食品生物技術。