畢赤酵母發酵生產甲醇蛋白工藝條件的優化

茍萬曉，衛紅偉，胡元森，王樂*

（1.義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司，河南義馬472300；2.河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001）

畢赤酵母發酵生產甲醇蛋白工藝條件的優化

茍萬曉1，衛紅偉2，胡元森2，王樂2*

（1.義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司，河南義馬472300；2.河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001）

利用實驗室選育馴化出的高產甲醇蛋白的畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）作為甲醇蛋白生產菌種，對甲醇蛋白發酵生產過程中的關鍵因素進行較為全面的考察和優化，初步確定了搖瓶水平發酵各因素的最優條件為接種量8%，分段發酵溫度采用0～36 h，30℃，36～64 h，28℃，初始pH值為5.0，初始甲醇添加量為1.2%，裝液量為50 mL/250 mL搖瓶，轉速為200 r/min。在此條件下，得到的甲醇蛋白最高產量（細胞干質量）為19.3 g/L。

甲醇蛋白；畢赤酵母；發酵；工藝條件；優化

以工業甲醇為原料生產出來的甲醇蛋白被稱之為第二代單細胞蛋白，與天然蛋白相比，其粗蛋白含量比魚粉和大豆都要高，且含有豐富的必需氨基酸、礦物質和維生素，可以部分替代魚粉、大豆、骨粉、肉類以及脫脂奶粉[1-2]。而且甲醇蛋白的原料易得、資源相對豐富、不占耕地、不依賴海洋、生產不受氣候條件影響、生產速度快[3]。甲醇蛋白生產成本低，以甲醇蛋白代替傳統的魚粉和豆類等蛋白，無疑會降低飼料成本，提高飼養效率，加速我國飼料工業的發展[4-6]。同時，利用現代微生物技術開發無糧食型，高效能生產蛋白質營養飼料是有力推進我國飼料工業發展的必要手段，是解決目前蛋白飼料短缺，依賴進口這一矛盾的有效途徑[7-9]。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達外源蛋白的表達系統，具有遺傳穩定、表達水平高、蛋白可翻譯后加工、產物可分泌、可高密度發酵等許多優點，應用十分廣泛[6]。畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏好性，可進行細胞高密度培養，且由于自身分泌到培養基中的蛋白很少，因此純化方便，利于大規模工業化生產[10]。不同外源蛋白要求不同的發酵工藝條件，可從發酵培養基、補料調節、溶解氧濃度、菌體密度等多個方面進行優化[11]。通過上述方面的調控可使外源蛋白表達量提高10%～900%[2]。因此對發酵工藝的優化調控是提高畢赤酵母外源蛋白表達量的重要手段之一[12]。

本實驗選取畢赤酵母作為發酵生產甲醇蛋白的原始菌株，經過誘變和馴化選育得到了具有適應實驗室所用底物的甲醇蛋白高產高效菌株。采用單因素試驗，考察和分析發酵過程中的培養基、接種量、溫度、pH值、裝液量、轉速等關鍵因素對甲醇蛋白產量的影響，旨在系統優化Pichia pastorisYM-SCP02菌株以甲醇為底物發酵生產甲醇蛋白的生產工藝。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）原始菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.2477，經過本課題組誘變與馴化選育后獲得了優良菌株Pichia pastorisYM-SCP02。該菌株能利用常規的工業甲醇生產菌體蛋白，與原始菌株相比，生長速率更快，甲醇產率更高。本菌株于4℃斜面試管中保存常用，-80℃甘油管中保存備用。

1.1.2培養基及培養條件

菌種的保存采用常規的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extractpeptone dextrose，YEPD）復合培養基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%、葡萄糖2%，瓊脂粉2%。

種子擴大培養：

（1）種子培養基采用YEPD復合培養基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%、葡萄糖2%，甲醇0.5%，KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.05%。

（2）種子發酵培養條件：250 mL搖瓶中裝50 mL培養基，生長溫度為30℃，培養基初始pH值為5.0，搖床轉速200 r/min，培養時間24 h。

發酵培養基組成：

選擇培養甲醇蛋白生產菌常用基礎發酵培養基BSM培養基，用于生產甲醇蛋白，初始甲醇的體積分數為1.0%，每隔20 h，補加甲醇0.5%。

基礎發酵培養基：85%磷酸26.7 mL/L，二水硫酸鈣0. 93 g/L，硫酸鉀18.3 g/L，七水硫酸鎂14.9 g/L，氫氧化鉀4. 13 g/L，甘油40 g/L，微量元素溶液8 mL/L。

微量元素溶液配方：五水硫酸銅6g/L，碘化鉀0.088g/L，一水硫酸錳3 g/L，二水鉬酸鈉0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水合氯化鈷0.5 g/L，氯化鋅20 g/L，七水合硫酸亞鐵65 g/L，生物素0.8 g/L，濃硫酸5 mL/L。

基礎發酵培養條件：在研究培養基各組分用量及單一因素發酵條件對甲醇蛋白產量影響時，發酵培養條件為250 mL搖瓶中裝50 mL培養基，生長溫度為30℃，培養基初始pH值為5.0，搖床轉速200 r/min，培養時間64 h。

1.1.3化學試劑

實驗所用的化學試劑純度均為市售分析純。

1.2儀器與設備

DGG-101-1電熱鼓風干燥箱、HP-9052恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ADVENTURER電子天平：奧豪斯儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；HZQ-X100振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；T-6可見-紫外分光光度計：北京新世紀電子技術開發有限公司；BH-2 Olympus顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Agilent1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1發酵液菌濃度的測定

將剛發酵結束的發酵液搖勻吸取2 mL，用去離子水定容至50 mL。用分光光度計測定其在波長630 nm處的吸光度值。

1.3.2發酵液pH值的測定

發酵開始后每隔2 h，采用無菌操作方法，利用精密pH計（精度為0.01），快速測定發酵液的pH值。

1.3.3濕菌質量與干菌質量的測定

（1）菌體干質量測定/甲醇蛋白含量

取50mL菌懸液，于稱質量后的干燥離心管內，4500r/min離心10 min，棄上清，固形物（菌體）用去離子水洗滌-離心2遍后，于55℃烘干至質量恒定，稱質量，為甲醇蛋白產量。

（2）菌體濕質量測定

取50mL菌體懸液于稱質量后的干燥離心管內，4500r/min離心10 min，棄上清，固形物（菌體）用去離子水洗滌-離心2遍后，直接稱質量。

1.3.4甲醇含量的檢測

甲醇含量的測定，參照GB/T 9722—2006《化學試劑氣相色譜法通則》。

2　結果與分析

2.1發酵培養基的優化

2.1.1磷酸和甘油對甲醇蛋白產量的影響

圖1　培養基中磷酸的量對甲醇蛋白產量的影響Fig.1 Effect of phosphoric acid addition in medium on methanol protein yield

由圖1可知，當磷酸的用量為原始量時（質量分數85%），53.4 mL/L），甲醇蛋白的產量相對于磷酸的用量為原始量1/2（26.7 mL/L）的75.4%，說明培養基中過高的磷酸濃度不利于甲醇蛋白生產菌的最大化生長。因此，最適的磷酸用量為原始量1/2，即26.7 mL/L時，甲醇蛋白產量最高，為18.4 g/L。

基礎發酵培養基配方中的甘油的原始含量為40 g/L。由圖2可知，甘油的用量為原始配方中1倍時，即甘油添加量為40 g/L時，甲醇蛋白產量能達到最高值，此時的甲醇蛋白含量為18.7g/L，這可能是由于甘油的用量較大時可使碳源量增大，在前期使得菌體增殖較快較多，有利于后期酵母細胞對甲醇的利用，提高了甲醇利用速率；甘油的用量較小時不能滿足甲醇蛋白生產菌的最快生長時對碳源的需求，同時發酵液中菌體量不夠，甲醇誘導生長時間較長，菌體容易出現中毒現象[13]。因此，培養基中最適的甘油質量濃度為40 g/L。

圖2　培養基中甘油用量對甲醇蛋白產量的影響Fig.2 Effect of glycerinum addition in medium on methanol protein yield

2.1.2不同生物素添加量對發酵生產菌體蛋白影響

考察不同生物素添加量（生物素的濃度為5‰，添加量為0.4～2.0 mL）對發酵生產菌體蛋白影響，結果見圖3。

圖3　培養基中生物素用量對甲醇蛋白產量的影響Fig.3 Effect of biotin addition in medium on methanol protein yield

基礎發酵培養基配方中生物素的原始添加量為6mg/L。由圖3可知，當生物素的用量為原始配方時，即生物素添加量為6 mg/L時，發酵64 h后甲醇蛋白產量能達到最高值，此時甲醇蛋白的產量為18.3 g/L，表明生物素的添加量為6 mg/L即能滿足菌體發酵生產所需。增加生物素的添加量至6 mg/L，甲醇蛋白的產量持續增加，但隨著生物素添加量的繼續增加，甲醇蛋白的產量基本保持不變甚至略有降低。

2.1.3微量元素溶液的添加量對發酵生產菌體蛋白影響

微量元素溶液的添加量（0.4～1.0 mL/100 mL培養基）對發酵生產菌體蛋白有一定的影響，結果見圖4。

圖4　微量元素溶液的添加量對甲醇蛋白產量的影響Fig.4 Effect of microelement solution addition on methanol protein yield

由圖4可知，隨著微量元素溶液的添加量小幅度增加，甲醇蛋白產量有明顯增長。發酵64 h后，添加0.8 mL微量元素溶液/100mL培養基中甲醇蛋白產量值達到最高值，而添加0.4 mL微量元素溶液/100 mL培養基中的甲醇蛋白產量明顯低于0.8 mL/100 mL。因此最適的微量元素溶液添加量為0.8mL/100mL培養基，此時甲醇蛋白的產量為18.8g/L。

2.2發酵培養條件的優化

2.2.1接種量對甲醇蛋白產量的影響

不同接種量（4%～14%）對甲醇蛋白的產量有一定影響，結果見圖5。

圖5　接種量對甲醇蛋白產量的影響Fig.5 Effect of inoculum on methanol protein yield

由圖5可知，當接種量為8%（接種量與培養基體積比），甲醇蛋白產量最高。接種量＞10%時，由于菌體在初期對底物和營養成分的消耗過大，甲醇蛋白產量得不到明顯提高，同時還會導致發酵液稀釋嚴重，不利于甲醇蛋白的發酵生產[1]。當接種量＜5%時，甲醇蛋白的產量隨接種量的減少下降明顯，原因是甲醇濃度過高會對菌體產生一定抑制作用，接種量過低導致單位菌體受到甲醇的抑制作用增加，細胞生長的停滯期較長。同時，由于接種量過小，細胞的初始濃度過低，菌體進入發酵液后不能形成良好的種群優勢，抵抗微生物侵擾的能力顯著下降，細胞的正常生長和代謝也會受到影響，造成甲醇蛋白的產量降低[6]。綜上可知，最佳的接種量為8%。

2.2.2培養溫度對的發酵結果的影響

不同培養溫度（0～36 h，30℃，36～64 h，28℃和0～36 h， 28℃，36～64 h，30℃）對發酵結果的有一定影響，結果見表1。

表1　培養溫度對發酵結果的影響Table 1 Effect of temperature on fermentation result

適宜的發酵培養溫度對細胞的正常生長和代謝十分必要[3]。溫度對畢赤酵母發酵產物的活性、發酵液的物理性質及生物合成方向等都有影響[8]。由表1可知，28～32℃是畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）發酵生產甲醇蛋白的較適宜溫度范圍。溫度為32℃時，發酵結束后甲醇剩余量最低，但＜30℃細胞量的結果，說明較高的溫度利于菌體對甲醇的代謝，但并不利于細胞量的積累。溫度＜30℃時，隨著溫度的繼續降低，發酵結束后甲醇的殘留逐漸增高，細胞量呈現平穩上升，然后快速下降的趨勢。表明在一定的溫度范圍內，低溫誘導對分泌蛋白表達更有利，但隨著溫度的進一步降低，生化反應活性也隨之降低，最終導致甲醇蛋白的產量出現降低的結果[12]。考慮到較高溫度有利于菌體在初期快速生長，而較低的溫度更適宜的甲醇蛋白的積累，因此采用0～36 h，30℃，36～64 h，28℃為最優的培養溫度。發酵結束后甲醇蛋白的產量為19.2 g/L。

2.3初始pH值對發酵結果的影響

pH值是發酵調控中的關鍵參數，對微生物代謝的影響十分重要。采用滴加少許稀鹽酸或氫氧化鈉溶液對培養基初始pH值進行調節，考察不同初始pH值（3.0～8.0）對發酵結果的影響，結果見圖6。

圖6　初始pH值對甲醇蛋白產量的影響Fig.6 Effect of initial pH value on methanol protein yield

由圖6可知，發酵最適初始pH值為4.5～5.5，說明弱酸性的發酵環境更適宜菌體的生長和甲醇蛋白的積累，此時甲醇蛋白產量為19.1 g/L。當pH＜4.0時，甲醇蛋白的產量有所下降，可能是由于過低的pH值會影響膜表面電荷的性質及膜的通透性，進而影響對物質的吸收能力[2]。當pH值＞7.0時，隨著pH值的增加，甲醇蛋白的產量顯著下降，原因可能與過高的pH值會抑制菌體中某些酶的活性，影響微生物對營養物質的吸收及代謝，甚至造成菌體的新陳代謝受阻[10]。因此，選擇最適的發酵初始pH值為5.0。

2.4甲醇初始添加量對發酵結果的影響

考察不同甲醇初始添加量（0.4%～2.0%）對發酵結果的影響，結果見圖7。

圖7　甲醇初始添加量對甲醇蛋白產量的影響Fig.7 Effect of initial methanol addition on methanol protein yield

由圖7可知，不同甲醇添加量對甲醇蛋白產量的影響不同，隨著甲醇初始添加量（甲醇添加量與培養基質量比）逐步升高，甲醇蛋白產量逐漸增加之后又呈逐漸降低的趨勢，反映出畢赤酵母是甲醇營養型酵母，可以在以甲醇為碳源和能源的培養基中生長，但過高甲醇添加量抑制細胞的生長和產物的表達[14]。實驗發現甲醇添加量為1.2%時，甲醇蛋白的產量最大，高達19.0 g/L，而＞1.2%時，隨甲醇的添加量增加，甲醇蛋白的產量降低，表明較高甲醇添加量抑制菌體生長，因此最適的甲醇初始添加量為1.2%。

2.5裝液量和轉速對發酵結果的影響

在搖床轉速為200 r/min條件下，考察不同的裝液量（30～100 mL/250 mL搖瓶）對甲醇蛋白產量的影響，結果見圖8。

由圖8可知，裝液量＞80 mL/250 mL時，發酵結束后甲醇蛋白的產量＜16 g/L，隨著裝液量的進一步提高，甲醇蛋白產量下降的趨勢更加明顯。當裝液量＜80mL/250mL時，甲醇蛋白的產量隨著裝液量的降低呈現明顯的上升趨勢，在裝液量為50mL/250mL時達到最高產量18.9g/L。原因是畢赤酵母是好氧微生物，溶解氧濃度對菌體的生長和產物生成的影響很大，較高的溶氧條件是提高發酵效率和甲醇蛋白產量的重要保證[11]。但考慮到過低的裝液量會帶來成本的增加等不利因素，因此最適的裝液量為50mL/250mL。

圖8　裝液量對甲醇蛋白產量的影響Fig.8 Effect of liquid volume on methanol protein yield

圖9　轉速對甲醇蛋白產量的影響Fig.9 Effect of rotate speed on methanol protein yield

在裝液量為50 mL/250 mL條件下，考察不同轉速（120～280 r/min）對甲醇蛋白產量的影響，如圖9所示。轉速調節是改變發酵過程中溶解氧的重要方面，較高的轉速會提高氧的體積傳遞系數，增加發酵液中氧的供給[15]。因此選擇合適的搖瓶轉速，對提高畢赤酵母好氧發酵生產甲醇蛋白的產率十分重要。由圖9可知，當轉速＜180 r/min時，由于發酵過程中的轉速過低，溶氧濃度不能滿足細胞快速生長時對氧氣的需求，抑制的菌體的生長和繁殖，細胞增殖緩慢，甲醇蛋白產量較低。但若轉速＞250 r/min，發酵過程中的溶氧會過高，會發生細胞氧中毒的現象，此外過高的轉速細胞所承受的剪切力過大，甚至會加劇細胞死亡速率，甲醇蛋白產量迅速降低。因此，最適的轉速為200 r/min，此時的溶氧保持在有利于外源蛋白高效表達的范圍，也可以降低底物和有害廢物的抑制作用，細胞生長繁殖狀態良好，甲醇蛋白的產量最高，發酵結束后甲醇蛋白的產量高達19.0 g/L。

3　結論

對畢赤酵母（Pichia pastorisYM-SCP02）發酵生產甲醇蛋白工藝條件進行了優化，最適的發酵培養條件為接種量8%、發酵溫度采用0～36h，30℃，36～64h，28℃、初始pH值為5.0、初始甲醇添加量為1.2%，裝液量為50 mL/250 mL搖瓶、轉速為200 r/min，最終得到的甲醇蛋白最高產量（細胞干質量）為19.3 g/L。

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Optimization of fermentation conditions for methanol protein production byPichia pastoris

GOU Wanxiao1,WEI Hongwei2,HU Yuansen2,WANG Le2*

(1.Coal Biochemical Technology Engineering Co.,Ltd.of Yima Coal Industry Group,Yima 472300,China; 2.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

Pichia pastorisYM-SCP02 strain bred and domesticated in laboratory with high methanol protein yield was used for methanol protein production.The key factors of methanol protein fermentation were investigated and optimized,and the optimal fermentation conditions in the shake flask were determined as follows:inoculum 8%,segmented fermentation temperature 0-36 h,30℃and 36-64 h,28℃,initial pH 5.0,initial methanol addition 1.2%,liquid volume 50 ml/250 ml shake flask,and rotate speed 200 r/min.Under these conditions,the highest yield of methanol protein(cell dry weight)was 19.3 g/L.

methanol protein;Pichia pastoris;fermentation;technology conditions;optimization

TQ920.6

A

0254-5071（2014）07-0078-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.017

2014-05-08

河南工業大學博士科研基金項目（150493）

茍萬曉（1964-），男，工程師，本科，研究方向為生物化工。

*通訊作者：王樂（1984-），男，講師，博士，研究方向為發酵工程。