含乳飲料中甜蜜素的測定及提取方法的改進

王飛，農云軍，竇文淵，石燕麗（中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州510070）

含乳飲料中甜蜜素的測定及提取方法的改進

王飛，農云軍，竇文淵，石燕麗
（中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州510070）

對氣相色譜法測定含乳飲料中甜蜜素含量的方法進行優化和改進，先用蛋白酶去除含乳飲料中的蛋白，使其變成澄清的溶液再按國標方法提取衍生。在優化的色譜條件下，甜蜜素的分離度高，線性范圍為0.10～1.00 mg/mL，相關系數r=0.999 9，定量限為0.005 g/kg，相對標準偏差＜5.0%，回收率為96.7%～99.3%。結果表明，該方法前處理簡單方便，分析時間較短，精密度及準確度高。

含乳飲料；甜蜜素；提取方法；改進

甜蜜素的化學名稱為環己基氨基磺酸鈉，是一種無營養、甜度高的人工合成甜味劑。人體過量攝入會產生致癌、致畸、損害腎功能等副作用[1-2]，所以許多國家禁止使用或是限制使用甜蜜素作為食品添加劑，我國在GB2760—2011《食品添加劑使用衛生標準》中規定其在飲料中最大使用量為0.65 g/kg。甜蜜素的測定方法主要有氣相色譜法、氣質聯用法、液相色譜法、液質聯用法、離子色譜法、比色法、薄層色譜法等[3-13]。目前最常用的是GB/T5009.97—2003《食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》中推薦的氣相色譜法[13]，因為其快速、簡便、靈敏度高而一直為業界所推崇。但是由于標準出臺時間比較早，受到實驗條件和社會大環境的影響，制定標準時在技術上受到一定的限制。

依國標GB/T 5009.97—2003《食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》中規定的方法，目前對含乳飲料采用液體試樣的前處理方式，對于不同種類的液體樣品沒有詳細規定。但是，在實際的操作過程中，由于含乳飲料不是澄清的液體，存在著嚴重的沉淀和乳化現象，兩相之間分層不明顯，導致加標回收率低，影響了測定的準確性。因此，本實驗對含乳飲料的前處理方法進行了細節改進，優化了色譜條件，使其前處理方法簡單，得到甜蜜素的分離色譜峰峰形好，方法回收率高、相對標準偏差及檢出限令人滿意。此方法準確、穩定、快速，有很高的推廣實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

含乳飲料：市售；環己基氨基磺酸鈉對照品：美國Sigma公司；液體蛋白酶（酶活力16 000 U）：諾維信（中國）投資有限公司；正己烷、氯化鈉、亞硝酸鈉、濃硫酸均為分析純：廣州試劑廠；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A帶火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）檢測器和7693自動進樣器、Agilent Chemstation色譜工作站：美國安捷倫公司；BSA124S-CW電子天平：德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取1.000 g環己基氨基磺酸鈉對照品，用蒸餾水溶解定容于100 mL容量瓶中，得質量濃度為10.0 mg/mL的標準溶液。吸取10.0mg/mL甜蜜素標準液0.10mL、0.20mL、0.40 mL、0.80 mL、1.00 mL分別于100 mL具塞比色管中，加水至10 mL，相當于甜蜜素的質量濃度為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL，置于冰浴中，充分冷卻后，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液5 mL，100 g/L硫酸溶液5 mL，搖勻，在冰浴中放置30 min，經常搖動，取出，準確加入10.0 mL正己烷和5.0 g氯化鈉，密塞，手動振搖80次，靜置分層，吸出正己烷層，超濾后裝進樣瓶待測。

1.3.3 樣品處理

精密稱取含乳飲料樣品20.0 g，加入5 mL液體蛋白酶去除蛋白，室溫條件下放置10 min，離心取清液于100 mL比色管中，置冰浴中。按照國標GB/T5009.97—2003《食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》中規定的方法，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液5mL，100g/L硫酸5mL，搖勻，在冰浴中反應30 min，并經常搖動，然后準確加入10.0 mL正己烷，5 g氯化鈉，振搖80次，待分層后吸出正己烷層用0.45 μm微孔濾膜過濾，上機檢測。

2 結果與討論

2.1 對國標方法的改進

2.1.1 試樣制備方法的改進

國標方法中對于液體樣品的試樣制備是搖勻后直接取樣20.0g置于比色管中，冰浴后加入相應的衍生試劑反應30 min，再進行萃取。但是含乳飲料樣品本身是一種乳白色的懸濁液，含有大量的蛋白質，如果不進行任何預處理就直接加入亞硝酸鈉和硫酸溶液衍生，含乳飲料中的蛋白質在酸性條件下會發生變性而沉淀，大大影響了衍生效果，衍生效率只有40%～50%。因此，必須要先對含乳飲料進行預處理得到澄清的液體再加入衍生劑和萃取劑才能得到良好的實驗結果。本研究通過反復實驗，在國標方法的基礎上增加一步，先去除含乳飲料中的大量蛋白質，回收率會大大提高，即采取先向樣品中加入5mL液體蛋白酶，搖勻，室溫放置10 min，離心得到澄清的樣品溶液，再按照國標方法進行提取衍生。此去除蛋白的方法比文獻[14-15]報道的更簡單易行。如果萃取過程發生乳化現象，可以根據樣品的差異采取離心的方式或是加入少許乙醇進行消泡，有助于迅速分層。

2.1.2 樣品的保存時間的研究

眾所周知，通常衍生物的穩定性較差，但是國標方法中未提及樣品衍生后的保存及穩定性問題。將處理好的樣品溶液放置在4℃冰箱中冷藏，間隔一定時間（0、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）測定其峰面積，發現甜蜜素衍生產物-環己醇亞硝酸酯隨著時間的推移峰面積會變小，放置3 h后已減小了4.3%，5 h后已衰減了10%，這說明甜蜜素衍生物會隨著時間的延長而慢慢分解，質譜[5]證明其分解后生成了環己醇。由此可見，樣品提取完成后應在5 h內完成測定，如果是大批量樣品要把握好樣品的處理和上機測定時間，這樣才能保證樣品的穩定性及準確性。

2.1.3 色譜條件的選擇和優化

國標中采用的色譜條件為80℃恒溫，采用10%SE-30不銹鋼填充柱測定。目前石英毛細管柱較為普及，且分離效果較好，因此采用石英毛細管柱，分別比較了HP-1、RtxR-5、HP-innwax、FFAP等色譜柱，實驗表明，RtxR-5柱的分離效果最好。為了避免較低溫度的恒溫操作會有殘留物干擾下次測定，采用60℃起溫，保持1 min，以15℃/min的速率升至150℃，保持3 min的程序升溫方法，甜蜜素的峰形和分離度更好，雜質干擾小，保留時間適中，并且減少樣品中一些沸點較高的未知組分在色譜柱內的殘留，適用于定量分析，結果見圖1。

圖1 甜蜜素對照品(A)和樣品中甜蜜素(B)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of sodium cyclamate standard(A)and sample solution(B)

2.2 線性范圍和定量限

取不同質量濃度的對照品溶液，在選定的色譜條件下測定，質量濃度在0.10～1.00 mg/mL范圍內與峰面積線性良好，相關系數r為0.999 9。甜蜜素的定量限（S/N=10）為0.005g/kg。本方法的定量下限遠遠低于實際樣品的添加量。

2.3 精密度實驗

用0.40 mg/mL的甜蜜素對照品溶液，進樣1.0 μL，重復6次，結果如表1所示，保留時間和峰面積的相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD）分別為0.008%和1.05%，說明該方法精密度較好。

表1 精密度實驗結果(n=6)Table 1 Results of precision tests(n=6)

2.4 平行性實驗

按照“1.3.3”方法處理方法，取某品牌乳酸飲料樣品均勻取樣6份，按照上述色譜測定條件對其中的甜蜜素含量進行測定，結果如表2所示，RSD為2.75%，說明該方法具有良好的重復性，穩定可靠，能滿足檢測要求。

表2 平行性實驗結果Table 2 Results of parallel experiment

2.5 加標回收率實驗

取適量某品牌乳酸飲料樣品，在最佳的實驗條件下，按照“1.3.3”方法處理樣品，同時按加入約本底平均值50%～150%的對照品進行加標回收率實驗，結果如表3所示。

表3 回收率測定結果(n=5)Table 3 Results of recovery experiment(n=5)

由表3可知，加標回收率為96.7%～99.3%，RSD為1.10%～1.67%，說明該實驗準確度較好。

3 結論

對含乳飲料中甜蜜素含量的測定方法進行了細節性改進，在前處理時先加入蛋白酶去除蛋白，使其變成澄清的溶液再進行提取衍生，驗證了樣品的穩定性時間為5 h，采用RtxR-5毛細管柱程序升溫檢測甜蜜素，其線性范圍為0.10～1.00 mg/mL，相關系數r=0.999 9，RSD＜5.0%，回收率為96.7%～99.3%，方法的定量限為0.005 g/kg。結果表明該方法前處理簡單方便，分析時間較短，靈敏度高，用于實際樣品的測定，結果令人滿意，該方法對乳飲料中其他添加劑的檢測有借鑒作用，為從事食品安全檢測人員提供了一定的參考信息，在保障食品安全方面有著重要的實際意義。

[1]JACKSON C D,BAETCKE K P.Causative agents in the induction of bladder cancer[J].Ann Clin Lab Sci,1976,6(3):223-232.

[2]BOPP B A,SENDERS R C,KESTERSON J W.Toxicological aspects of cyclamate and cyclohexylamine[J].Crit Rev Toxicol,1986,16(3):213-306.

[3]郭蒙京，浦育，趙丹瑩.紅葡萄酒中甜蜜素的氣相色譜測定法[J].職業與健康，2010，26（4）：393-394.

[4]王貴雙，高麗華，趙俊平，等.氣相色譜法測定食品中甜蜜素定量方法的探討[J].中國釀造，2010，29（12）：159-161.

[5]王貴雙，高麗華，趙俊平，等.氣質聯用技術測定食品中甜蜜素定性分析的探討[J].中國釀造，2011，30（12）：171-172.

[6]李羽翡，周春紅.頂空氣相色譜-質譜法測定甜蜜素初探[J].食品與發酵科技，2012（2）：101-103.

[7]王珮，王宏.食品中環己基氨基磺酸鈉-氣相色譜法測定原理探討[J].食品科學，2008，29（2）：324-327.

[8]何良興，林賽君，柯春暉，等.高效液相色譜柱前衍生法測定蜜餞中的甜蜜素[J].食品科學，2009，30（4）：204-206.

[9]夏于林，李明春，張瑩，等.液相色譜串聯質譜法同時測定白酒中4種甜味劑方法研究[J].中國釀造，2011，30（3）：156-157.

[10]徐琴，牟志春，郝杰，等.高效液相色譜-質譜法測定輸韓泡菜中的甜蜜素[J].食品科學，2012，33（4）：186-188.

[11]朱懷遠，莊亞東，熊曉敏，等.離子色譜法直接測定食品添加劑中的甜蜜素[J].食品科學，2012，33（2）：173-176.

[12]劉波.葡萄酒中甜蜜素含量測定方法探討[J].中國釀造，2010，29（7）：171-172.

[13]中華人民共和國衛生部.GB/T 5009.97—2003食品中環己基氨基磺酸鈉的測定[S].北京：中國標準出版社，2004.

[14]孔祥建，馮亮.毛細管柱氣相色譜法測定乳制品中的甜蜜素[J].現代食品科技，2011，27（6）：723-726.

[15]黃向榮，緒紅霞，陳秀華，等.毛細管氣相色譜法測定餅干中環己基氨基磺酸鈉[J].中國實用醫藥，2012，18（7）：251-252.

Determination of sodium cyclamate in milk beverage and extraction method improvement

WANG Fei,NONG Yunjun,DOU Wenyuan,SHI Yanli

(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for sodium cyclamate content determination in milk beverage by gas chromatography was optimized.The protein in the milk beverage was removed by protease,and derived according to National Standard method.On conditions of optimized gas chromatography,the separating degree of sodium cyclamate was better,the linear detection range was 0.10-1.00 mg/ml(r=0.999 9)and the limit of quantity was 0.005 g/kg.The recovery rate and precision were in the range of 96.7%-99.3%and relative standard deviation(RSD)was less than 5.0%.Results indicated this method has simple pretreatment,shorter analysis time with high precision and accuracy.

milk beverage;sodium cyclamate;extraction method;improvement

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0095-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.021

2014-05-04

廣東省自然科學基金資助項目（7300055）；中國廣州分析測試中心自籌資金科研項目（20100008）

王飛（1979-），女，副研究員，博士，研究方向為食品與環境分析檢測。