抗氧化劑的超高效液相色譜-串聯質譜法測定

唐麗娜，寧煥焱，曾憲遠，羅運福，奉夏平*（廣東省惠州市質量計量監督檢測所，廣東惠州516003）

抗氧化劑的超高效液相色譜-串聯質譜法測定

唐麗娜，寧煥焱，曾憲遠，羅運福，奉夏平*
（廣東省惠州市質量計量監督檢測所，廣東惠州516003）

研究了油炸食品中化學合成酚類抗氧化劑--丁基羥基茴香醚（BHA）、二叔丁基對甲酚（BHT）、沒食子酸丙酯（PG）、特丁基對苯二酚（TBHQ）的檢測，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定，以反相C18為分離柱，乙腈-甲醇水體系為流動相進行梯度洗脫，采用負離子檢測模式，外標法定量。4種抗氧化劑呈良好線性關系（R2=0.995 3～0.999 8），PG方法檢出限為2.0 μg/kg，BHA、TBHQ檢出限為200 μg/kg，BHT檢出限為500 μg/kg?；厥章蕿?9%～96%，相對標準偏差為0.9%～5.3%，方法準確、靈敏、重現性好，可用于油炸食品中抗氧化劑的檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜法；抗氧化劑；檢測；油炸食品

目前國際上開發的人工化學合成抗氧劑種類超過100種，但被各國認可，符合安全、高效的抗氧化劑只有十幾種，合成抗氧化劑的優點抗氧化作用強、熱穩定性好、抑菌及相對低廉的價格[1]。最常使用的合成抗氧化劑包括有：叔丁基對羥基茴香醚（butylatedhydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基對苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、特丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）、沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）等，這四種抗氧化劑均為苯酚型結構化合物的酚類抗氧劑，能清除自由基、淬滅單線態氧、抑制氧化酶活性，阻斷油脂自動氧化鏈式反應機制，所以具有很強的抗氧化性能，常單獨或幾種混合使用在食品中[2]。

油炸食品中含有許多不飽和脂肪酸，極易氧化或分解而變質，影響食品的風味、品質及營養價值，甚至產生對人體健康有害的物質[3]。向食品中加入符合我國食品安全法規定的抗氧化劑，可有效防止或延緩食品變質，保持營養風味。目前，各國對4種抗氧化劑的使用都有嚴格的限量規定，我國食品安全國家標準中也有明確的限定[4-5]。在許多情況下，這四種抗氧化劑經常復合使用，針對這種狀況，有必要建立一種能同時準確測定多種抗氧化劑的快速分析方法，適應油炸食品中抗氧化劑的檢驗需求[6]。

抗氧化劑的檢測方法有比色法、薄層色譜法[7]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-9]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8，10]、氣質聯用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[11-12]、液質聯用法（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）等[13-15]，而超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLCMS/MS）技術具有靈敏度高，選擇性好，檢測速度快的特點。本研究以油炸薯片、沙琪瑪及方便面為研究對象，利用超高效液相色譜-串聯質譜法對食品中4種酚類抗氧化劑進行了測定研究。該方法選擇性高、靈敏、快速，10 min內可完成上機檢測，滿足同時測定油炸食品中多種抗氧化劑準確定量的要求，可為制定食品中多種抗氧化劑的檢測標準提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純：美國Honeywell公司；甲酸、抗壞血酸及無水硫酸鈉均為分析純：濟南盈動化工有限公司。

飽和正己烷：將正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振搖，使其相互飽和。靜置分層，收集上層溶液，即為飽和正己烷。

0.1 %抗壞血酸乙腈-甲醇（4∶1，V/V）混合液：將正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振搖。靜置分層后，收集下層溶液，加甲醇，且于每升溶液中溶解1 g抗壞血酸（ascorbic，ASA）。

檢測樣品油炸薯片、沙琪瑪及方便面購自超市。

標準溶液的配制：分別準確稱取4種抗氧化劑各10 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成100 mg/L標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。使用時根據需要儲備溶液0.1%抗壞血酸混合液分別配制成合適濃度的系列混合標準工作液。

1.2 儀器與設備

島津LC-30液相色譜儀：日本島津公司；API-4000質譜儀：美國AB公司；Syncore平行蒸發儀：瑞士BUCHI公司；RE-6000旋轉蒸發儀：上海榮亞生化儀器廠；MS-2旋渦混合器：德國IKA公司；Integral-3超純水儀：美國Millipore公司；Toppette移液槍：上海恒奇儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend C18柱（4.6 mm×150 mm× 2.1 μm）；流動相：乙腈（A），0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨甲醇水（20∶80，V/V）溶液（B），柱溫為36℃；進樣量為4 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition of high performance liquid chromatography

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI）；檢測方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；碰撞氣（CAD）為0.02 MPa；氣簾氣（CUR）為0.08 MPa；霧化氣（GS1）為0.17 MPa；輔助加熱器（GS2）為0.19 MPa；噴霧電壓（IS）為4 500 V；離子源溫度為450℃。多反應監測各離子對及各優化參數見表2。

表2 抗氧化劑的LC-MS/MS質譜參數Table 2 LC-MS/MS parameters for antioxidants

1.3.3 樣品處理方法

稱取混合均勻的樣品5.0g（精確至0.1mg），置于100mL玻璃比色管中，加入40 mL飽和正己烷振蕩提取5 min，再加入20 mL含0.1%抗壞血酸乙腈-甲醇（4∶1，V/V）混合液渦旋振蕩5 min，過濾后（用5 mL混合液洗滌濾紙2～3次）轉移至分液漏斗中，靜置分層，收集下層溶液；再加入20 mL乙腈-甲醇混合液，重復萃取兩次，合并提取液于濃縮瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮至1 mL左右，最后將濃縮用抗壞血酸含0.1%的乙腈-甲醇混合液定容至5 mL，經0.20 μm濾膜過濾后作為待測液。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

分別用甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈作為萃取溶劑，比較抗氧化劑的萃取效率。結果表明，甲醇和乙醇萃取出較多弱極性的雜質，對BHA和BHT的測定有干擾，需過柱。而異丙醇提取PG、BHT回收率不高，影響結果的準確性。采用乙腈作為提取溶劑時，雜質含量相對偏低，效果較好，用正己烷溶解油脂與分析靶標，降低溶液黏度，再用乙腈萃取，回收效果理想。另外在萃取時加入保護劑ASA，能促進氧化的微量金屬離子鈍化，從而降低抗氧化劑在提取和濃縮過程中被氧化的程度，保證方法的靈敏度、準確度與回收率。

2.2 色譜條件的選擇

選用通用性強的SB-C18色譜柱對4種抗氧化劑進行分離。由于抗氧化劑大多數是極性比較強的酚類化合物，易分解，因而常出現色譜峰拖尾、鬼峰及不對稱等現象。在流動相中加入適量的酸性抑制劑可抑制此類化合物的電離，改善峰形。實驗發現，以乙腈-0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨甲醇水（20∶80，V/V）為流動相，4種抗氧化劑均得到很好的色譜峰以及較好的分離度。

2.3 質譜條件的優化

由于大多數抗氧化劑含有酚羥基，容易生成去質子化的分子離子，其生成正離子的豐度較小，靈敏度不及負電離模式，所以在實驗中BHA、BHT、PG、TBHQ 4種抗氧化劑均選用ESI-電離模式。

采用蠕動泵進單標的方式確定兩組反應監測（MRM）離子對，優化相應質譜參數，使靶標化合物的定性離子、定量離子產生的離子對強度比例大而穩定，選擇響應值強、基質干擾小的子離子作為定量離子。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

準確配制一系列濃度的混合標準工作溶液，按上述的儀器條件進行測定，以標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸分析。以信噪比S/N=3、取樣量5.0 g計算檢出限。結果見表3。

由表3可知，4種抗氧化劑在一定質量濃度范圍內呈良好線性關系，PG的檢出限為2.0 μg/kg，TBHQ、BHA的檢出限為200 μg/kg，而BHT的檢出限相對較高，為500 μg/kg。

表4 樣品加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Recovery of standard addition and RSD of samples(n=6)

2.5 方法的精密度與回收率

準確稱取油炸薯片、沙琪瑪和方便面3種具有代表性且基體較復雜的樣品各5.0g，分別添加1倍、2倍、5倍檢出限的3個濃度水平進行加標回收實驗，每個水平重復測定6次，計算方法的回收率和相對標準偏差（relative standard devi ation，RSD），結果見表4。由表4可知，4種抗氧化劑的回收率為79%～96%，相對標準偏差為0.9%～5.3%，表明方法準確可靠，精密度良好。加標樣品的總離子流圖見圖1。

圖1 加標樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of adding standard samples

2.6 樣品測定結果

采用本方法對油炸薯片、沙琪瑪和方便面進行測定，其結果（表5）可知，樣品中抗氧化劑往往都是以復合方式使用。食品安全國家標準GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》中規定油炸食品、方便食品、糕點等食品中PG最大使用量為0.1 g/kg，TBHQ、BHA、BHT均為0.2 g/kg，而且各自用量占其最大使用量的比例之和≤1[5]。通過分析檢測，在油炸薯片、沙琪瑪、方便面中都有檢測到不同濃度的抗氧化劑，其中BHA含量較高。但未超過國家標準所規定的最大使用限量。

表5 樣品實際分析結果Table 5 Results of samples determination

3 結論

采用加入L-抗壞血酸（ASA）的飽和乙腈萃取的前處理方法，建立UPLC-MS/MS多反應監測模式分析檢測食品中4種抗氧化劑的方法。該方法準確、靈敏、回收率高，回收率為79%～96%，RSD 0.9%～5.3%，而且10 min內完成分析檢測，能有效的提高工作效率，可用于油炸食品、糕點、方便食品中酚類抗氧化劑的檢測，適用范圍廣。

[1]彭輝.油脂、含油食品的氧化、抗氧化以及抗氧化劑[J].食品工業，2004（3）：34-36.

[2]蔡發，段小娟，牟志春，等.液相色譜-串聯質譜法測定食品中的12種抗氧化劑[J].分析測試學報，2012，31（12）：45-48.

[3]李秀勇，牟峻，劉慧濤，等.超高效液相色譜-質譜法測定油脂中的10種抗氧化劑[J].分析化學研究簡報，2008，36（3）：369-372.

[4]申世剛，董文靜，周建科.油炸薯條中酚類抗氧劑的高效液相色譜法測定[J].食品與發酵工業，2008，8（29）：270-273.

[5]中華人共和國衛生部.GB 2760—2011食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2011.

[6]周建科，張前莉，韓康，等.油炸食品中兩種酚類抗氧化劑的反相高效液相色譜法測定[J].食品研究與開發，2006，27（7）：166-168.

[7]LATIMER G W.Association of official analytical chemists official methods of analysis[J].Arlington:Aoac Intl,2012.

[8]TANIMURA A.Shokuhin chu no shokuhintenkabutsu bunsekiho kaisetsusho[M].Japan:Kodansha,1992.

[9]PAGE P D.Liquid chromatographic method for the determination of nine phenolic antioxidants in butter oil:collaborative study[J].J AOAC Int, 1993,76(13):765-779.

[10]YU L Z,INOKO M,MATZUNO T.A gas chromatographic method for rapid determination of additives in vegetable oils[J].J Agr Food Chem, 1984,32(10):681-683.

[11]OHTA M,NARITA M,MIYOSHI T,et al.Analysis of BHA,BHT and TBHQ in chewing gum by GC and GC/MS[J].J Food Hyg Soc Jpn, 1997,38(6):78-84.

[12]MIZUNO T,TAJIMA K,OKINO N,et al.Derivatization of butylated hydroxytoluene for gas chromatography with electron-capture detection and high performance liquid chromatography with ultraviolet detection [J].J Chromatogr A,1985,333(12):171-174.

[13]OISHI M,MATSUDA T,NOJIRI S.Simultaneous determination of five antioxidants in foods byHPLC with fluorescence detection[J].Shokuhin Eiseigaku Zasshi,2002,43(8):104-109.

[14]CHOONG Y M,LIN H J.Gas chromatographic determination of synthetic antioxidants in edible fats and oilsa simple methylation method [J].J Food Hyg Drug Anal,2001,20(9):20-25.

[15]ANDRIKOPOULONS N K,BRUESCHWEILER H,FELBER H,et al. HPLC anaysis of phenolic antioxidants,tocophenols and triglycerides [J].J Am Oil Chem Soc,1991,68(3):359-364.

Determination of antioxidants by UPLC-MS/MS

T ANG Lina,NING Huanyan,ZENG Xianyuan,LUO Yunfu,FENG Xiaping*
(Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute,Huizhou 516003,China)

A new method was established to detect four kinds of phenolic antioxidants in fried foods including BHA,BHT,PG,TBHQ by ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UHPLC-MS/MS).The samples were detected by C18column by gradient elution using methanol-acetonitrile as mobile phase,and it was detected by negative ion detection mode and external standard method.The calibration curves of the four antioxidants were in good linear relationship(R2=0.995 3～0.999 8).The detection limit of PG,BHA,TBHQ and BHT were 2.0 μg/kg,200 μg/kg,200 μg/kg and 500 μg/kg,respectively,and the relative standard deviation was in the range of 0.9%～5.3%.The method was suitable for the analysis of four antioxidants mentioned above in fried foods with good accuracy and precision.

UPLC-MS/MS;antioxidant;detection;fried food

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0098-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.022

2014-05-29

惠州市科技項目（2011B020006017）

唐麗娜（1975-），女，工程師，碩士，研究方向為分析化學。

*通訊作者：奉夏平（1975-），男，工程師，碩士，研究方向為分析化學。