反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量

王振偉，魏家紅（黃河水利職業技術學院，河南開封475000）

反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量

王振偉，魏家紅
（黃河水利職業技術學院，河南開封475000）

建立反相高效液相色譜法測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量。采用Waters Sunfire ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2%磷酸緩沖溶液（60:40），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。結果表明，在上述色譜條件下，蘆丁和槲皮素良好分離，質量濃度分別在2～100 μg/mL（R2=0.999 1)和1～100 μg/mL(R2=0.999 2)之間線性關系良好。平均加標回收率分別為98.27%和99.15%，相對標準偏差（RSD）分別為2.98%和3.76%，重現性實驗RSD分別為蘆丁2.18%(n=5)，槲皮素1.76%(n=5)。測得刺梨中蘆丁和槲皮素的平均含量分別為7.070 mg/g和1.352 mg/g。RP-HPLC法簡便快捷、靈敏，結果準確，可用于刺梨中黃酮成分含量的檢測。

刺梨；黃酮；反相高效液相色譜；蘆丁；槲皮素

刺梨（Rosa roxburghii）是薔薇科薔薇屬落葉灌木，又名繅絲花、文先果、送春歸，是集藥用、保健、食用、觀賞為一體的綠色特新水果，多分布于貴州、云南、河南等省。刺梨營養價值及食用價值極高，已有報道刺梨有提高免疫功能、延緩衰老、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、解毒鎮靜、降血脂等多種生物學作用[1-4]，近年來，有關刺梨果實中豐富的天然抗氧化物質（黃酮類化合物及超氧化物歧化酶等）引起人們的廣泛關注[5-8]。

黃酮類化合物作為刺梨的主要生物活性成分之一，具有消除自由基、抗氧化、降血糖血脂、降血壓、抗腫瘤等作用，其中蘆丁和槲皮素是其主要活性成分，蘆丁具有降低毛細血管通透性、抗病毒、鎮痛、抗氧化及抑制醛糖還原酶等藥理活性，槲皮素具有降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性、降血脂、增加冠脈血流量等作用。因此研究刺梨中蘆丁和槲皮素含量的測定對于刺梨的質量評價及資源的開發利用具有重要的意義。蘆丁和槲皮素的分析檢測方法已報道有分光光度法、催化動力學光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、熒光光譜法等[9-15]，其中最常用的是高效液相色譜法。為了綜合開發刺梨這種植物資源，本實驗用微波輔助提取刺梨中的總黃酮，并建立了反相高效液相色譜法同時測定蘆丁和槲皮素含量的方法，為刺梨制品質量評價和資源利用提供可借鑒的簡便、可行、效率高、重復性好的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：購自河南開封醫藥大廈。

蘆丁、槲皮素（標準品）：中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純）：天津四友精細化學品有限公司；磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、無水乙醇等均為分析純：天津德恩化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

MDS-6微波消解萃取儀：上海新儀微波化學科技有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀、2487紫外檢測器：美國沃特世公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；HC-3018R冷凍離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液制備

干燥的刺梨果實粉碎過40目篩，準確稱取粉末2.00 g，置于具塞三角燒瓶中，加入體積分數為60%的乙醇40 mL，微波功率400W輔助提取3min，離心分離得到上清液，轉移至50 mL容量瓶中加體積分數為60%的乙醇定容作為待測液，進樣前用0.45 μm濾膜過濾后作為供試品溶液[1，8]。

1.3.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒質量的蘆丁標準品及槲皮素標準品各25 mg，全部置于25 mL容量瓶中，加體積分數為80%的乙醇溶解并定容至刻度，配成蘆丁和槲皮素質量濃度均為1 mg/mL的混合對照品標準溶液。精密量取此混合標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻過濾后備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Waters sunfire ODS C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40）；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL，檢測波長以掃描為準。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

我的畫院：畫院坐落在美麗的地方，有很多美麗的故事。如果想到其與宋代有著各種聯系，立刻讓人感到渺小，又讓人振奮，力爭創作出美麗的畫，以不負各方。

將蘆丁和槲皮素對照品溶液利用紫外分光光度計在波長200～600 nm范圍內掃描，最大吸收峰對應的波長即為檢測波長，結果如圖1所示。結果表明，在波長254 nm和360 nm處有兩個吸收峰，鑒于低波長處雜質的干擾，選用360 nm作為檢測波長。

圖1 蘆丁和槲皮素標準品紫外光譜圖Fig.1 Spectrogram of rutin and quercetin standard samples

2.2 標準曲線的繪制

精密吸取1.3.2中配制好的質量濃度為1μg/mL、2μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的混合對照品溶液各10μL進樣，以峰面積（Y）為縱坐標，對照品溶液的質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖2。蘆丁和槲皮素的線性回歸方程為Y=15 618X-11 087（R2=0.9991）和Y=2063.7X-923.8（R2=0.9992）。結果表明，蘆丁和槲皮素質量濃度分別在2～100μg/mL和1～100μg/mL之間線性關系良好。

圖2 蘆丁和槲皮素標準曲線Fig.2 Standard curves of rutin and quercetin

2.3 精密度實驗

為考察方法的穩定性，在上述色譜條件下，精密吸取質量濃度為50 μg/mL的混合對照品溶液10 μL進樣，重復進樣5次，記錄其峰面積分值，結果見表1。分別計算蘆丁、槲皮素的峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，其中蘆丁RSD為0.85%、槲皮素RSD為0.97%，結果表明，精密度良好。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiment

2.4 重現性實驗

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of repeatability experiment

2.5 加標回收率實驗

為考察方法的準確度，精密移取5份已知含量的樣品供試液200 μL。分別精密加入100 μg/mL的混合對照品溶液50μL混合，精密吸取10μL。在上述色譜條件下進行分析，結果見表3。由表3可知，蘆丁平均回收率98.27%，RSD為2.98%，槲皮素平均回收率99.15%，RSD為3.76%表明實驗準確性好。

表3 回收率實驗結果Table 3 Results of recovery experiment

2.6 樣品含量的測定

圖3 混合標準對照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B)

按照上述色譜條件，在波長360 nm條件下，分別精密吸取蘆丁和槲皮素混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL進樣。其色譜圖結果見圖3。

由圖3可知，混合對照品中蘆丁和槲皮素分離良好，通過保留時間進行定性，蘆丁標樣的保留時間為2.406 min，槲皮素標樣的保留時間是4.449 min，樣品分別在2.315 min和4.633 min中出現峰值。這兩種物質在10 min內能夠完全分離，互不干擾。除了蘆丁和槲皮素在刺梨黃酮提取物中存在，仍有很多未知成分亟待確定。隨后的工作中，需對刺梨中其他幾種黃酮成分進行定性和定量分析，進一步確定刺梨中黃酮的種類和含量。

準確吸取樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定蘆丁和槲皮素峰面積，平行3次，按照外標法計算刺梨果實樣品中蘆丁和槲皮素的含量，結果見表4。

表4 刺梨樣品中蘆丁和槲皮素含量測定結果(n=3)Table 4 Determination results of rutin and quercetin in samples(n=3)

由表4可知，蘆丁和槲皮素是刺梨黃酮的主要成分，其中蘆丁的平均含量為7.070 mg/g，槲皮素的平均含量為1.352 mg/g，RSD值均＜3%。反向高效液相色譜法用于同時測定刺梨中蘆丁和槲皮素的含量，具有可行性。

3 結論

蘆丁和槲皮素是刺梨果實中主要的黃酮成分，可以作為刺梨黃酮測定的指標。實驗采用微波提取刺梨果實中蘆丁和槲皮素，方法操作簡便、樣品前處理簡單、提取效率高。采用反向液相色譜法測定蘆丁和槲皮素含量，以甲醇-0.2%磷酸緩沖溶液（60∶40）作為流動相能夠保證蘆丁和槲皮素在10 min之內出峰，分析速度快，分離效果好。實驗建立的同時測定刺梨中蘆丁和槲皮素含量的方法，簡化了分析過程，方法迅速、結果可靠，可為刺梨資源的合理開發利用和質量評價提供理論依據。

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Determination of rutin and quercetin inRosa roxburghiiby RP-HPLC

WANG Zhenwei,WEI Jiahong (Yellow River Conservancy Technical Institute,Kaifeng 475000,China)

RP-HPLC method for quantitative determination of rutin and quercetin in Rosa roxburghii was established.Waters sunfire ODS C18column (4.6 mm×150 mm,5μm)was used as fixed phase,and methanol-0.2%phosphate buffer solution(60:40)was used as mobile phase running with a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 360 nm and the column temperature was 30℃.The results showed that rutin and quercetin were well separated by this method.The rutin and quercetin were in good linear relationship in concentration range of 2-100 μg/ml(R2=0.999 1)and 1-100 μg/ml(R2=0.999 2),respectively.The standard addition recovery was 98.27%and 99.15%,relative standard deviation was 2.98%and 3.76%, and the relative standard deviation of reproducibility experiment was 2.18%(n=5)and 1.76%(n=5),respectively.The average content of rutin and quercetin in Rosa roxburghii were 7.07 mg/g and 1.352 mg/g.The RP-HPLC method was simple,quick,accurate and sensitive,which can be used in rutin and quercetin content determination.

Rosa roxburghii;flavonoids;RP-HPLC;rutin;quercetin

O657.72

A

0254-5071（2014）07-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.025

2014-05-12

河南省教育廳自然科學基金項目（12B530003）

王振偉（1980-），男，講師，碩士，研究方向為天然產物提取分離及活性研究。