海寧裕豐傳統玫瑰醋優勢醋酸菌分離及培養

高澤鑫，孫曉彤，黃勛，高冰*

（1.武漢生物工程學院生物科學與技術系，湖北武漢430415；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；3.湖北工業大學輕工學部，湖北武漢430068）

海寧裕豐傳統玫瑰醋優勢醋酸菌分離及培養

高澤鑫1，孫曉彤2，黃勛1，高冰3*

（1.武漢生物工程學院生物科學與技術系，湖北武漢430415；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；3.湖北工業大學輕工學部，湖北武漢430068）

以浙江海寧裕豐玫瑰醋醋醪為實驗材料，從醋醪中分離培養出3株發酵性能高且菌種活力穩定的優勢醋酸菌菌株As4，Af6，Ad2。利用形態學觀察、培養特征和生理生化特征對其進行細菌學鑒定，最后將其確定為醋酸桿菌屬中的醋化醋桿菌Ad2、巴氏醋桿菌As4和惡臭醋桿菌Af6。其中醋化醋桿菌Ad2菌株醋酸產量在分離菌株中最高，且在實驗室條件下32 h內總產酸可達1.02 g/mol，是可進一步誘變提高其產酸率并用于生產的理想菌株。

玫瑰醋；培養；鑒定；醋酸桿菌

食醋在我國已具有兩千多年的歷史，是我國傳統的酸性調味品。我國傳統的釀造醋有鎮江香醋、山西老陳醋、福建紅曲醋、四川麩醋、北京熏醋、浙江玫瑰醋等產品[1]，各具特色。浙江玫瑰米醋以其天然玫瑰紅色來命名，酸味柔和綿長，醋香純正，鮮而微甜，獨具風味，是我國食醋中的佳品。該食醋不但用作調味品，而且是理想的保健食品可調配飲用。

傳統的玫瑰醋生產是以大米為原料，在浙江地理環境基礎下，利用環境中天然野生菌種（如醋酸菌、霉菌、酵母菌），經表面靜置液態發酵法釀造而成的不添加任何色素、甜味劑、酸味劑，具有玫瑰紅色的釀造食醋[2-4]。生產工藝簡單，但環境依賴性大，由于是天然發酵，產品質量容易受氣溫、濕度等環境因素的影響。因此有必要對浙江玫瑰醋的微生物群落結構變化進行研究，并對其發酵過程中的優勢菌種進行改進，從而改善其生產工藝，縮短生產周期[5-7]。從而提高其生產效率，達到增加產品在市場中的競爭力與影響力的目的。

本研究以浙江玫瑰米醋作為實驗對象，從醋醪中分離出產酸效能高的優勢醋酸菌菌株[8]，并對其進行純化，研究其生物學特征鑒定其歸屬。這對研究浙江玫瑰醋發酵中微生物的區系分布有一定的意義[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

菌種來源于浙江海寧裕豐釀造有限公司，從該公司玫瑰米醋醋醪中分離得到的醋酸菌菌株，現由武漢輕工大學生化樓409實驗室保藏。

1.1.2 培養基

醋酸菌增殖培養基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30 mL/L無水乙醇，乙醇在滅菌后培養基溫度降至75℃左右加入。

醋酸菌固體分離培養基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，碳酸鈣20 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30mL/L無水乙醇（滅菌后加入）。

保藏斜面培養基：葡萄糖5 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，碳酸鈣15 g/L，pH 5.5，121℃滅菌20 min，30 mL/L無水乙醇（滅菌后加入）。

產酸試驗培養基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30 mL/L無水乙醇（滅菌后加入）。

醋酸菌種子液培養基：蒸餾水25 mL，葡萄糖0.25 g，酵母膏0.25 g，pH自然，121℃滅菌20 min，750 μL無水乙醇（滅菌后加入）。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖（分析純）、碳酸鈣（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：上海強順化學試劑有限公司。其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LHS-250SC型恒溫恒濕培養箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；SLY-2112B型恒溫培養搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：廣東瑞智科學儀器有限公司；YM50F型壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；BM2000型光學顯微鏡：南京江南永新光學有限公司；LIV-1800PC型紫外可見分光光度計：上海光譜達儀器有限公司；BL6100電子天平：德國SARTORIUS公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌純化分離試驗流程

1.3.2 操作要點

增殖培養：從玫瑰香醋醋醪中吸取1 mL原始醋醪液加入100 mL醋酸菌增殖培養基中放入30℃的恒溫培養搖床中180 r/min培養1 d，從而得到大量混合菌種。

光鏡觀察：用接種環從增殖培養基中蘸取混合液樣品到已經滴好生理鹽水的載玻片上，輕輕攪動讓其混合均勻，再放入顯微鏡下觀察菌落形態。

平板稀釋涂布[10]：吸取醋酸菌增殖培養基中的菌液1mL到EP管中，再通過EP管進行依次稀釋，稀釋至1×10-6梯度。吸取1×10-4、1×10-5、1×10-6這三種梯度的EP管液各100μL加入到醋酸菌固體分離培養基中。涂好后將培養基放入恒溫培養箱中30℃倒置培養48 h。

革蘭氏染色：挑選出溶鈣圈大，菌膜豐滿，邊緣整齊的單菌落，放置于新的固體分離培養基平板上劃線培養，得到較純的醋酸菌菌種，進行革蘭氏染色。

菌種發酵培養：將分離得到的不同種類的醋酸菌菌株分別放入醋酸菌種子液培養基中，30℃、180 r/min培養12h，再倒入200 mL產酸試驗培養基中，30℃的恒溫培養搖床180 r/min培養2 d。

1.3.3 產醋酸定性試驗

將分得的疑似醋酸菌菌株分別接種于醋酸菌種子液培養基中，30℃培養48 h后，取5 mL培養液，用10%NaOH將培養基pH值中和至中性，后加入10%氯化鐵2～3滴搖勻，形成紅褐色沉淀者為產醋酸菌。

1.3.4 初篩

將分得的疑似醋酸菌菌株根據革蘭氏染色和產醋酸定性試驗篩選出革蘭氏陰性且產醋酸的菌株為醋酸菌。

1.3.5 產酸定量試驗

將已確定為醋酸菌菌種的種子培養液以10%的接種量接種于產酸試驗培養基中，30℃、180r/min條件下振蕩培養48h，在這段時間中每2h對發酵液總酸度進行測量。總酸測定方法依照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[11]。

1.3.6 菌株生長曲線[12]

每隔2d取一定量的發酵液分光光度計測其波長600 nm處吸光度值。測得的吸光度值再減去原始發酵培養基（沒加入種子液的發酵培養基）的吸光度值，余下的則為菌株的種子生長系數。

1.3.7 優勢菌株篩選

根據不同屬種的醋酸菌菌株產酸性能的高低和菌株種子生長曲線進行對比，從而選擇出優勢的醋酸菌菌株。

1.3.8 菌株鑒定[13-14]

依據《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》對已確定為醋酸菌的菌株進行鑒定對比，以確定醋桿菌的屬種。

2 結果與分析

2.1 初篩結果與分析

2.1.1 光鏡下觀察結果

圖1 光學顯微鏡下的菌落形態特征(×400)Fig.1 Colony morphology characteristics of optical microscope(×400)

通過圖1可以看出，對浙江玫瑰醋初次增殖培養出的菌種不純，有球菌、桿菌和弧菌等。根據這種情況體現出傳統浙江玫瑰醋發酵是多種微生物參與的混合發酵，因此對發酵過程中的優勢菌種進行改進，首先要對浙江玫瑰醋的傳統工藝和微生物來源及演化規律進行深入研究，這是首要的環節，也是其他各項工作開展的前提條件，同時也反映出對其單一傳統優勢菌種進行純化分離與鑒定的必要。

2.1.2 菌落形態特征

通過稀釋涂布的醋酸菌固體分離培養基生長中得到的單一菌落，應用溶鈣圈法初篩，再經過純化分離（劃線法），最后采用梯度稀釋，將稀釋后的菌樣接種到固體培養基上，挑選出溶鈣圈最大的三株菌株As4、Ad2、Af6，結果見圖2。

圖2 As4、Ad2、Af6醋酸菌菌株培養第2天的菌落形態特征Fig.2 Colony morphology of As4,Ad2,Af6acetic acid bacteria strains on the second day cultivation

2.1.3 菌株發酵培養與產酸性能對比

將初篩選出的3株菌種分別接種于發酵培養基中，30℃，180 r/min條件下振蕩培養24 h，測定發酵液中總酸含量。

圖3 優勢醋酸菌菌株的產酸情況Fig.3 Acid production conditions of the dominant strains

通過圖3可以看出，這三種菌株的發酵結果為Ad2菌株產酸量高于As4菌株和Af6菌株，由此可得出Ad2菌株為優勢菌株，對Ad2菌株用試管斜面培養基進行轉接，4℃低溫保藏備用。

2.2 菌種復篩結果與分析

2.2.1 光鏡下觀察結果

通過圖4可以看出，復篩培養出的Ad2菌株形態特征多為橢圓狀菌體有少許退化型特征，多為球狀和伸長狀，單生或成對或成鏈生長，大小為（0.6～0.7）μm×（0.9～1.5）μm，不產生芽孢。菌落圓形，突起，表面光滑，在含碳酸鈣的固體培養基上能產生透明圈，且菌落為肉色。

圖4 光學顯微鏡下的Ad2菌株形態特征(×400)Fig.4 Ad2strain morphology under an optical microscope(×400)

2.2.2 Ad2菌株發酵產酸性能與菌株生長曲線

圖5 Ad2菌株種子生長曲線Fig.5 Growth curve of Ad2strain

圖6 Ad2菌株產酸情況Fig.6 Acid production condition of Ad2strain

通過對Ad2菌株進行深層發酵，得出該菌株生長的最佳活性時期是發酵前12 h，并通過對菌體OD值的測定，繪出菌株種子的生長曲線見圖5。由于菌體干質量測量經過的步驟比較多，所受的影響也比較大，如每個三角瓶在接種時會存在一定的系統誤差；離心后烘至質量恒定會受到時間、溫度以及分析天平的影響，因此該方法的準確度不是很高并且工作量較大。但采用測OD值的方法可以解決這種缺點，而使得菌體周期的測定變得簡潔和具有較高的精確度。由圖6可以看出，Ad2菌株產酸量隨時間增長一直在穩步上升，28 h后醋酸菌產酸量達到一個緩慢增長的時期，32 h內總產酸為1.02 g/100 mL。在食醋釀造中醋酸菌產酸占據了非常重要的地位，提高其產酸量對食醋增產有很大意義。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態學特征

三株菌株的形態特征見表1，As4與Af6形態成橢圓形，Ad2的形態成短桿狀，都無芽胞。As4與Ad2排列特征為成對或成鏈，Af6為單個或成對。

表1 菌株的形態特征Table 1 Morphological characteristic of strains

2.3.2 菌落培養特征

三株菌株的單菌落特征見表2。

表2 菌株的培養特征Table 2 Cultural characteristic of strains

2.3.3 生理生化特征

三株菌的生理生化特征見表3。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.3.4 鑒定結果

在表1～表3中所列生物學特性的前提上，依據《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》，鑒定本試驗分離出的菌株均為醋酸桿菌屬（Acetobacter），主要依據生化反應鑒定As4為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），Af6為惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens），Ad2為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）。

3 結論

本研究以浙江玫瑰米醋作為研究對象，從醋醪中分離篩選出了一株產酸效能高且菌種生長活力旺盛的醋酸菌菌株Ad2菌株。Ad2菌種在實驗室條件下32 h內總產酸為1.02 g/100 mL。相對于在同期發酵產酸的As4和Af6菌株，Ad2菌株發酵性能好，是優勢菌株。

通過生理生化鑒定，得出Ad2菌株為革蘭陰性菌，初步確定該株菌屬于醋化醋桿菌（Acetobactor aceti），該菌種嚴格好氧，適宜生長溫度28～35℃，pH為5.5～6.3，酸性氧化乙醇為醋酸，產酸能力穩定，且生長活力旺盛。由于Ad2菌株的優良特征，如果在后期對其進行完整分子生物學鑒定并確定其菌株的亞種，即可進一步誘變提高菌種產酸能力，讓該菌種成為可用于生產的理想菌株。醋酸菌代謝控制的關鍵在于適當增加菌株代謝溶解氧、前體物和適宜的發酵溫度[15]，適當的調整發酵條件來找到該菌株的最佳生長環境。

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Separation and cultivation of dominantAcetobacter aceticfrom traditional rose vinegar in Haining Yufeng area

GAO Zexin1,SUN Xiaotong2,HUANG Xun1,GAO Bing3*

(1.Department of Biological Science&Technology,Wuhan Institute of Bioengineering,Wuhan 430415,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 3.College of Light Industry,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Using rose vinegar mash in Zhejiang Haining Yufeng as experiment material,three strains of acetic acid bacteria with high fermentation performance and stable culture activity As4Af6,Ad2were separated from vinegar mash.Bacteriology identification was conducted by morphological observation,cultural characteristics,physiological and biochemical characteristics observation.In the end,Ad2was identified asAcetobacter aceti, As4asAcetobacter pasteurianus,and Af6asAcetobacter rancens.Among the three strains,Acetobacter acetiAd2had the highest acid production,and the total acid output in 32 h could reach 1.02 g/mol under laboratory conditions,it could be further induced to improve its acid production rate,and it would be an ideal strain in practice of vinegar production.

rose vinegar;cultivation;identification;Bacillus aceticus

TS201.3

A

0254-5071（2014）07-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.029

2014-05-18

高澤鑫（1993-），男，本科生，研究方向為發酵食品。

*通訊作者：高冰（1963-），男，高級工程師，本科，研究方向為微生物發酵。