GTPs對PD小鼠脊髓前角星形膠質細胞過度活化的影響及機制探討

葉 俊，磨潔琳，陳 敏

(1桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林541001;2廣西醫科大學人體解剖學教研室; 3桂林醫學院人體解剖學教研室)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年人的中樞神經系統慢性神經退行性疾病，發病率隨年齡的增加而增高，其病理改變主要是中腦黑質多巴胺能神經元的漸近性丟失及壞死，臨床上出現肌強直、肢體震顫和運動減少等癥狀［1］。目前，大量致病機制假說涉及環境毒素、氧化應激、線粒體功能破壞、興奮性氨基酸毒性、鈣離子失衡、膠質細胞過度活化、自身免疫、細胞凋亡等，最終導致PD的發生、發展［2］。其中，氧化應激學說得到了廣泛認可。2012年12月～2013年6月，我們觀察了綠茶多酚(GTPs)對PD小鼠脊髓前角星形膠質細胞過度活化的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 雄性SPF級C57BL/6J小鼠45只，6～8周齡，體質量20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供;飼養條件:桂林醫學院實驗動物中心飼養室。自由攝食、飲水，待適應環境1周后進入實驗。MPTP［3］、小鼠抗大鼠膠質原纖維酸性蛋白(GFAP，Sigma公司);GTPs(浙江東方茶業科技有限公司)，純度100%，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量為70.75%;超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成公司);其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 動物分組及模型制備 45只小鼠隨機分為3組各15只。模型組以MPTP腹腔注射，7 d，30 mg/ (kg·d);預防組同以上述劑量注射MPTP，但制備模型前3個月開始GTPs干預［小鼠飲水中摻入GTPs，濃度為0.1%(W/V)］至注射MPTP結束;正常組連續7 d腹腔注射與MPTP同體積的生理鹽水，飲水中未加入GTPs。制模成功標準:在注射MPTP 5～10 min內出現躁動不安、立毛、豎尾、細小震顫，尤以下頜點頭狀震顫多見。而后活動減少，常蜷縮聚臥成團，爬行蹣跚常見后肢托曳。上述急性中毒反應于給藥3 h后逐漸減弱，12 h后基本消失，但小鼠活動仍減少。

1.3 GFAP陽性細胞變化觀察 末次注射藥物或生理鹽水次日處死動物取得樣品標本。用1%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，灌注4%多聚甲醛固定(0.1 mol/L PB液配制pH值7.4)，取頸膨大(頸Ⅲ～胸Ⅱ)和腰膨大(胸Ⅻ～腰Ⅲ)，后固定4 h(4℃)，梯度蔗糖溶液(0.1 mol/L PB液配制pH值7.4)相繼下沉后橫斷連續冰凍切片，片厚40μm，隔三取一。切片經0.01 mol/L PBS(pH值7.4)漂洗后以3%H2O2消除內源性過氧化物酶;正常山羊血清室溫封閉;小鼠抗大鼠GFAP(1∶1 000)4℃過夜，生物素結合IgG (1∶200)、鏈菌素抗生物素—過氧化酶(1∶200)相繼室溫孵育2 h。ABC法染色。切片風干，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照實驗除以PBS代替GFAP外，其余步驟與上述相同，反應結果為陰性。光鏡下觀察脊髓GFAP陽性細胞變化。

1.4 GFAP陽性細胞計數 每只動物選擇3張頸、腰膨大切片，觀察脊髓前角，計數GFAP陽性細胞(放大倍數10×40)，分析系統對細胞數進行定量測定。

1.5 星形膠質細胞變化觀察 各組中隨機挑選2只動物，腹腔注射1%水合氯醛(40 mg/kg)進行麻醉，經心灌注4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合液200 mL。取頸膨大和腰骶膨大脊髓前角，切成1 mm3的小塊，送電鏡室制做超薄切片，醋酸鈾—枸櫞酸鉛染色。電鏡下觀察各組脊髓前角星形膠質細胞變化。

1.6 SOD、MDA檢測 各組動物分別處理結束后5 d各取8只小鼠，小鼠迅速斷頭取脊髓頸膨大和腰骶膨大，冰上快速分離前角組織，吸干稱重后充分勻漿，離心30 min(14 000 r/min，4℃)。參照試劑盒說明書檢測SOD和MDA水平。

1.7 統計學方法 采取SPSS17.0統計軟件。應用單因素方差分析(ANOVA)進行處理，根據方差齊性與否選擇相應的檢驗方法，即方差齊的資料用LSD法檢驗進行兩兩比較，方差不齊的資料兩兩比較用Games-Howell法檢測。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組GFAP陽性細胞變化 結果見圖1。由圖1可知，各組GFAP陽性細胞形態無明顯差異。

圖1 各組GFAP陽性細胞(標尺示25μm)

2.2 各組GFAP陽性細胞計數 結果見表1。

表1 各組GFAP陽性細胞計數(個/視野，±s)

表1 各組GFAP陽性細胞計數(個/視野，±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別GFAP陽性細胞頸膨大 腰膨大模型組 12.36±2.75* 13.21±3.22*預防組 9.28±1.90# 9.87±1.88#正常組6.68±1.91 7.98±1.67

2.3 各組星形膠質細胞變化 模型組出現較多活化的星形膠質細胞，增生、肥大，常成群分布，細胞胞體、胞核增大，胞質豐富，其內細胞器增多;正常組與預防組活化的星形膠質細胞較少。

2.4 各組SOD、MDA水平比較 結果見表2。

3 討論

以往有關PD的研究通常聚焦于中腦黑質及紋狀體，對于同為中樞神經系統的脊髓探究甚少。脊髓是中樞神經系統組成部分，尤其是在運動的發起、執行和控制等，脊髓前角的病變在本課題組之前的研究中已涉及，并且以GTPs預防性干預能緩解多巴胺能神經元的損傷，但GTPs是否能緩解星形膠質細胞過度活化卻鮮見報道［4，5］。神經元是人腦基本的構成單位，被膠質細胞緊緊包圍，膠質細胞的數量比神經元多出10～50倍，且占據了腦體積的一半。而在所有的膠質細胞中星形膠質細胞數量最多，其異常激活是PD黑質多巴胺神經元變性、缺失及進行性變性級聯放大的重要原因［6～8］。中腦黑質多巴胺能神經元的漸近性丟失及壞死，路易氏體(LB)的形成是PD的特征性病理變化，但是目前研究傾向認為黑質既不是首先更不是惟一受累的部位。越來越多證據證明，在胃腸道、唾液腺、迷走神經背核都有LB的形成，提示PD病變部位更加廣泛，并不局限于黑質和紋狀體，涉及中樞神經系統其他部分，甚至是全身性疾病，本研究結果與此是一致的。

表2 各組SOD、MDA水平比較(±s)

表2 各組SOD、MDA水平比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別SOD(U/mg)頸膨大 腰膨大MDA(nmol/mg)頸膨大 腰膨大模型組 51.00±8.81* 54.00±7.91* 1.76±0.21* 1.67±0.19*預防組 68.00±6.85# 69.00±6.32# 1.36±0.28# 1.39±0.22#正常組79.00±5.08 81.00±6.12 0.92±0.27 0.87±0.12

中樞神經系統常見退行性疾病如老年性癡呆、PD、多發性硬化等，星形膠質細胞的異常激活能進一步促進上述退行性疾病的病理發生和進程，其產生的大量致炎因子以及氧化應激分子導致神經元的二次損傷［9～11］;同時，神經元的損傷又能刺激膠質細胞的不斷激活，從而形成了病理過程的惡性循環［12］。星形膠質細胞適度激活對能保護多巴胺能神經元，而迅速增殖的星形膠質細胞將損傷部位快速隔離，形成一個相對局限封閉的環境，阻斷炎癥向周圍區域擴散［13］;釋放眾多神經保護因子如NGF、BDNF、GDNF，可保護多巴胺能神經元免受神經毒素的侵襲。長期、大量的不良刺激誘發星形膠質細胞過度活化，產生炎癥因子如IL-1、TNF-α、IL-10及干擾素誘導蛋白等損傷多巴胺能神經元，成為PD持續進展的病理因素之一。由于先天的缺陷或環境因素的作用，中腦黑質多巴胺能細胞無法有效的清除在氧化過程中產生的某些細胞的毒物如自由基，導致其含量超過正常的范圍，進而破壞脂類、蛋白和核酸等，由此產生的“氧化應激”，會導致多巴胺能細胞死亡。

GTPs是一種抗氧化劑，是植物綠茶中所提取的富含兒茶素的多酚化合物。其內大量含有的最有活性的EGCG，具有明確的抗氧化、清除自由基的積極作用［14，15］。近年來研究表明，EGCG在許多神經變性疾病中具有神經保護作用［16～18］。EGCG是GTPs的重要活性成分，主要以原型存在于血液和靶器官中，且能夠通過血腦屏障滲透進入神經系統，成為其發揮神經保護作用的前提［19］。GTPs是具有公認的抗氧化及清除自由基作用［20］。本研究提示，GTPs能夠減輕MPTP模擬PD模型造成的脊髓星形膠質細胞的過度活化，降低SOD及提高MDA水平和活性，增加抗氧化能力。

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