硫化氫對大鼠肝纖維化的抑制作用及機制探討

丁彥光，鄭如恒，肖祥之

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院，上海201700)

肝纖維化是各種慢性肝病共有的病理改變，是各種慢性肝病發展至肝硬化的必經階段，是在病毒性肝炎、慢性乙醇或藥物中毒、血吸蟲肝病以及營養缺乏等多種因素的作用下，引起肝細胞變性、壞死，導致炎癥反應，刺激纖維組織增生而形成的。肝纖維化的病理特征是膠原的生成與降解失衡，導致細胞外基質(ECM)合成增多，降解相對不足，ECM的過度沉積。目前認為，肝星狀細胞(HSC)是肝臟中產生膠原等外基質的主要細胞，而肝損傷—肝實質炎癥—壞死-HSC激活—大量ECM沉積是肝纖維化發生機制的中心環節［1］。當前眾多研究資料表明，如能早期發現并及時治療肝纖維化，病情可得到有效控制，肝纖維化尚有逆轉的可能，因此阻斷肝纖維化的進一步發展成為治療慢性肝病的關鍵［2，3］。硫化氫(H2S)是當前生物醫學領域中的又一嶄新課題，其具有擴張血管、抑制血管平滑肌增殖和抗氧化應激等多種生物學效應。目前關于這一新的氣體信號分子在肝纖維化發生、發展過程中的作用機制尚不多見。2011年10月～2013年10月，我們觀察了外源性H2S對四氯化碳(CCL4)誘導大鼠肝纖維化的抑制作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠50只，體質量為200～220 g，購自復旦大學醫學院實驗動物中心。

1.2 試劑 硫氫化鈉(NaHS，美國Sigma公司);透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原(CⅣ)放射免疫檢測試劑盒(上海海軍醫學研究所);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司);兔抗鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)。

1.3 大鼠肝纖維化模型制備及處理 將50只雄性SD大鼠隨機分為5組各10只，空白對照組皮下注射花生油2.0 mL/kg體質量，肝纖維化組注射同劑量40%CCL4花生油，NaHS低劑量組注射同劑量40% CCL4花生油+NaHS 7μmol/kg，NaHS高劑量組注射同劑量40%CCL4花生油+NaHS 14μmol/kg，秋水仙堿組注射相同劑量40%CCL4花生油+秋水仙堿0.25 mg/kg灌胃，每周2次，共8周［4］。

1.4 標本采集 實驗第8周末處死大鼠，留取血液及肝組織標本，取出肝臟后用冷的等滲鹽水灌注沖洗，選取部分肝臟組織，然后用10%中性甲醛固定，留做病理及免疫組化檢查，鏡檢觀察肝細胞變性與膠原纖維增生程度。

1.5 肝功能與脂質過氧化指標檢測 留取大鼠血液后分離血清，采用全自動生化檢測儀檢測ALT、AST。選取肝左葉同一部位組織，制備成肝勻漿，采用放射免疫法檢測肝臟組織HA、LN、PCⅢ、CⅣ;按試劑盒說明書操作步驟檢測肝組織SOD、MDA、 GSH-Px的酶活性。

1.6 肝臟病理學檢查 常規HE染色觀察肝組織學改變，網狀纖維和masson染色觀察肝纖維組織增生狀況。每張切片隨機觀察10個視野。根據肝組織病理變化，將大鼠肝纖維化的程度分為4期:0期為無纖維化;Ⅰ期為匯管區纖維化擴大，局部竇周及小葉內纖維化;Ⅱ期為匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留;Ⅲ期為纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化;Ⅳ期為早期肝硬化，纖維結締組織在全小葉多處彌漫性增生，假小葉形成。

1.7 肝組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原檢測 采用免疫組化法。所有肝組織標本均經10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4μm厚度連續切片。實驗步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片、光鏡下觀察結果。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肝功能與脂質過氧化指標比較 結果見表1。

表1 各組肝功能與脂質過氧化指標比較(±s)

表1 各組肝功能與脂質過氧化指標比較(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與肝纖維化組比較，#P＜0.05

組別 ALT(U/L) AST(U/L) HA(U/L) LN(U/L) PCⅢ(U/L) CⅣ(U/L) SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)肝纖維化組 184.9±80.9* 259.1±37.4* 331.6±13.4* 69.4±11.5* 215.3±51.0* 48.6±15.4* 87.7±17.2* 12.3±2.2* 37.3±6.6* NaHS低劑量組 106.0±21.9# 187.8±48.2# 270.3±37.4# 52.7±9.1# 176.4±37.6# 41.3±17.1# 106.1±15.9# 10.4±3.5# 46.5±11.3# NaHS高劑量組 82.4±26.9# 107.5±35.0# 222.5±22.1# 48.5±6.4# 98.7±33.5# 25.8±9.7# 115.5±27.9# 7.3±1.7# 56.8±23.6#秋水仙堿組 58.5±21.2# 75.2±20.9# 162.0±24.5# 43.0±8.7# 67.7±23.8# 19.9±5.6# 148.1±32.0# 4.8±0.9# 75.9±19.0#空白對照組 44.6±9.2 79.4±17.6 117.4±16.0 38.3±8.1 58.0±13.2 10.1±3.2 187.2±32.1 3.6±1.4 91.1±13.4

2.2 各組肝臟病理形態 對照組大鼠肝組織的肝組織結構正常，肝小葉結構完整，肝細胞索由中央靜脈向四周排列整齊，中央靜脈及匯管區結締組織未見增生。肝纖維化組肝小葉結構紊亂，肝細胞廣泛脂肪性變，匯管區炎性細胞、壞死細胞增多，纖維間隔向小葉內伸展形成大小不一纖維包繞，細胞索排列紊亂，纖維間隔增厚，可見假小葉形成，可見明顯的大量炎細胞浸潤。NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組均明顯減輕肝纖維化程度，肝細胞脂肪變性程度減輕，雙核肝細胞較少，庫普弗細胞增生、肥大，匯管區膠原纖維較肝纖維化組顯著減少，少量炎細胞浸潤，對炎性細胞浸潤、膠原纖維的增生以及肝小葉的破壞和假小葉的形成等均有明顯的改善。

2.3 各組肝臟膠原增生程度比較 對照組大鼠肝組織肝小葉完整、肝索排列整齊，結構正常，肝細胞無脂肪變性，在匯管區與中央靜脈周圍有微量膠原纖維分布。肝纖維化組肝細胞廣泛脂肪變性，肝索排列紊亂，匯管區炎性細胞、壞死細胞增多，匯管區和小葉內出現局限性的纖維化，部分區域出現纖維分隔，肝小葉結構破壞，甚至有假小葉形成。與肝纖維化組比較，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組肝組織膠原纖維異常分布明顯減少，變性壞死肝細胞減少，結締組織輕度增生。對照組肝纖維化分級均為0級;肝纖維化組大多為3～4級;NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組大多為1～2級，與肝纖維化組比較纖維化程度明顯減輕(P均＜0.05)。

2.4 各組肝組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達 空白對照組肝臟Ⅰ型膠原陽性染色只見于匯管區和中央靜脈管壁，Ⅲ型膠原主要存在于大血管周圍;肝纖維化組肝臟Ⅰ型、Ⅲ型膠原廣泛存在于纖維間隔及肝細胞內。與肝纖維化組比較，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟中Ⅰ型、Ⅲ型膠原明顯減少，纖維間隔較薄。

3 討論

肝纖維化是多種類型細胞、氧化應激、細胞因子和生長因子等一系列復雜作用的結果，是以ECM成分的過度增生與異常沉積為主要特征。HSC是肝臟ECM的主要來源，是肝纖維化形成的細胞學基礎，肝損傷—肝實質炎癥—壞死-HSC激活—大量ECM沉積，是肝纖維化發生機制的中心環節。因此，阻斷肝纖維化的發生和發展，對防治肝硬化和肝癌具有重要意義。氧化應激、脂質過氧化與肝纖維化形成的關系密切，氧化和抗氧化損傷的失衡可以促進HSC的增殖，導致膠原合成增加。各種因素造成的肝損傷產生了大量的脂質過氧化物，超出了機體的清除能力，使其發生脂質過氧化、MDA水平提高、SOD含量減少。脂質過氧化產物還可以損傷Kuppfer細胞、肝細胞，引起變性壞死，使氧自由基以及各種細胞因子大量釋放，致HSC被激活，大量ECM沉積，進而導致肝纖維化的發生。幾乎所有臨床和實驗性肝纖維化都被證實與氧化應激有關。

H2S是一種無色、易燃、能溶于水的，具有臭雞蛋氣味的氣體，數十年來，H2S只是作為一種污染環境的有毒氣體而被關注。20世紀90年代，Abe等［5］首次證明人體內源性H2S可作為一種神經活性物質而存在，而越來越多的實驗證據表明，H2S不僅可以在人和動物組織內被代謝和生成，而且還廣泛參與機體多種生理和病理過程，H2S不僅可以調節學習、記憶及神經元的興奮性，而且H2S還同NO和CO一樣，具有擴張血管和消化道平滑肌、抑制平滑肌細胞增殖和清除氧自由基的作用。內源性H2S作為氣體小分子可以自由通過細胞膜，其作用不依賴于相應的質膜受體，而是在吡多醛-5'-磷酸依賴性酶包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶的作用下催化產生，并發生相應的調控作用［6］。H2S其細胞學效應可以依賴或不依賴第二信使cAMP的介導，具有特定的細胞和分子作用的靶點［7］。

近年來研究［8］證實，H2S在肝纖維化及門脈高壓的發生、發展過程中起重要的保護性作用。有研究［9］發現，肝硬化患者血漿H2S降低與肝功能有關，能明顯降低肝臟谷氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶的水平。本研究顯示，肝纖維化組ALT、AST較空白對照組升高，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組ALT、AST較肝纖維化組降低，此與沈欽海等［10］研究一致。

研究［11］證明，氧應激下H2S對HSC具有保護作用，可抑制肝纖維化的發生、發展，提示H2S能夠參與氧化應激反應。SOD、GSH是機體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶，其反映了機體清除氧自由基的能力［12］。MDA是脂質過氧化的重要終產物，反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，它可促進Ⅰ型膠原的mRNA表達，與HSC增殖和膠原合成密切。本研究顯示，肝纖維化組MDA較空白對照組升高，SOD、GSH-Px較空白對照組降低; NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組MDA較肝纖維化組降低，SOD、GSH-Px較肝纖維化組升高，此與王宏賓等［13］研究結果相同。

另外有研究發現，HA、LN、PCⅢ及CⅣ與肝纖維化形成關系密切相關［14］。本研究顯示，肝纖維化組HA、LN、PCⅢ、CⅣ較空白對照組升高，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組HA、LN、PCⅢ、CⅣ較肝纖維化組降低;且NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組肝纖維化程度較肝纖維化組減輕，肝組織膠原纖維異常分布較肝纖維化組減少。均提示外源性H2S能減少膠原的生成，抑制肝纖維化的進程，其機制可能是通過抑制HSC的激活，減少ECM的合成，從而發揮抗纖維化作用。

肝纖維化是以HSC的大量增殖，ECM過度沉積，膠原合成與表達增多，并在肝臟間質內聚集為重要表現，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原是肝內主要的間質型膠原。本研究顯示，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組Ⅰ型、Ⅲ型膠原較肝纖維化組減少。其機制可能是NaHS在抑制肝臟HSC增殖的同時還抑制其膠原的合成與表達，此與劉文東等［15］研究結果一致。

總之，外源性H2S能有效抑制肝纖維化的發生、發展，其機制可能與其清除自由基、提高抗氧化物酶的活性、抑制HSC的膠原合成、減少ECM在肝臟中的沉積有關。

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