連翹酯苷對(duì)豚鼠順鉑耳毒性損傷的防護(hù)作用及機(jī)制探討

趙安未，侯學(xué)東，富公弼

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院，沈陽(yáng)110024)

順鉑是治療頭頸部及泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的化療藥物，除了可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序［1］。但是，順鉑與耳蝸組織結(jié)合后可激發(fā)產(chǎn)生大量的自由基，諸如超氧化物、過(guò)氧化氫、毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物等，這些氧自由基的增加可引起耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增高并因此而導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡［2］;同時(shí)，順鉑還可明顯降低耳蝸組織中抗氧化酶類的活性，產(chǎn)生內(nèi)耳毒性［3］。連翹酯苷是連翹屬植物中的咖啡酰糖苷類中主要有效成分之一，其具有顯著的抗氧化、抗微生物感染和清除自由基、減輕過(guò)氧化損傷的作用。然而，連翹酯苷是否對(duì)順鉑的耳毒性起防護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了連翹酯苷對(duì)豚鼠順鉑耳毒性損傷的防護(hù)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 注射用順鉑(10 mg/支，齊魯制藥廠)，連翹酯苷凍干粉(天津一方科技有限公司)，兔抗蛋白激酶B(p-Akt)多克隆抗體(Santa-Cruz公司)，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二乙基焦碳酸鹽(Sigma公司)，TRIzol試劑(北京鼎國(guó)生物公司)，Oligod T引物(由北京奧科生物技術(shù)公司合成)，LB563BEA型耳聲發(fā)射分析測(cè)試系統(tǒng)(IHC公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 選用30只健康豚鼠，體質(zhì)量250～300 g，雌雄不限，所有動(dòng)物耳廓反射靈敏。由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組和連翹酯苷組各10只。動(dòng)物自由食水，自然光照周期，穩(wěn)定1周后用于實(shí)驗(yàn)。順鉑組及連翹酯苷豚鼠每天腹腔注射順鉑8 mg/kg，連續(xù)7 d;連翹酯苷組在每天腹腔注射順鉑溶液30 min前，腹腔注射連翹酯苷25.0 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d;正常組以生理鹽水代替順鉑溶液注射，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)期間所有動(dòng)物均在安靜狀態(tài)下飼養(yǎng)并給予常規(guī)飲食。

1.3 畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)幅值檢測(cè) 在隔音室內(nèi)，豚鼠以戊巴比妥腹腔注射麻醉(50 mg/kg)，采用LB563BEA型耳聲發(fā)射分析測(cè)試系統(tǒng)(IHC公司，美國(guó))對(duì)處于麻醉狀態(tài)的豚鼠進(jìn)行DPOAE檢測(cè)。選擇初始純音f1與f2，f1/f2=1.22，強(qiáng)度差L1-L2=10 dB SPL，取DPOAE幅值超過(guò)本底噪音3 dB為DPOAE檢出標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)試頻率f02=f1×f2為1、2、4、6、8 kHz處的幅值。

1.4 耳蝸組織p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè) ①免疫組化法:將豚鼠麻醉，先用生理鹽水從左心室灌注，同時(shí)剪開右心房。當(dāng)右心房流出清亮液體后，再用10%中性緩沖甲醛灌注固定。斷頭剝離耳蝸，甲醛固定過(guò)夜，用0.4 mol/L EDTA(pH值7.2)脫鈣7 d。常規(guī)石蠟包埋，平行于蝸軸方向切片，按SP試劑盒說(shuō)明書測(cè)定p-Akt表達(dá)，采用圖像分析軟件計(jì)算光密度值。②Western blot法:將豚鼠麻醉處死，剝離出雙側(cè)耳蝸，置于4℃預(yù)冷的PBS中。在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出耳蝸組織(基底膜及血管紋)，剪碎，加入組織裂解液中，4℃下勻漿，離心取上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)印、4℃封閉過(guò)夜，一抗p-Akt(1∶200)和β-actin(1∶400)室溫孵育2 h，TTBS洗滌10 min，3次，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TTBS洗滌10 min，3次，ECL顯影并掃描測(cè)光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，各組比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組豚鼠DPOAE幅值比較 結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，與正常組比較，順鉑組測(cè)試頻率2、4、6、8 kHz處DPOAE幅值降低(P＜0.01);與順鉑組比較，連翹酯苷組測(cè)試頻率2、4、6、8 kHz處DPOAE幅值升高(P＜0.05)。

圖1 3組豚鼠DPOAE幅值檢測(cè)結(jié)果

2.2 3組豚鼠耳蝸組織p-Akt蛋白表達(dá)比較 ①免疫組化結(jié)果:見(jiàn)圖2，由圖2可知對(duì)照組豚鼠耳蝸底轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，染色程度非常強(qiáng);順鉑組豚鼠耳蝸底轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少，染色程度也較輕;連翹酯苷組耳蝸底轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)p-Akt陽(yáng)性染色程度明顯增強(qiáng)。對(duì)照組、順鉑組、連翹酯苷組豚鼠耳蝸p-Akt陽(yáng)性表達(dá)的光密度值分別為0.79±0.08、0.34±0.04、0.61± 0.06，對(duì)照組、連翹酯苷組與順鉑組比較 P均 ＜0.01。②Western blot結(jié)果:見(jiàn)圖3，由圖3可知對(duì)照組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白表達(dá)條帶清晰粗大，順鉑組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白表達(dá)條帶明顯變淺變細(xì)，連翹酯苷組的蛋白條帶介于兩者之間。對(duì)照組、順鉑組、連翹酯苷組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值分別為0.71±0.07、0.24±0.02、0.39±0.04，對(duì)照組、連翹酯苷組與順鉑組比較，P＜0.05或0.01。

3 討論

順鉑為鉑的金屬絡(luò)合物，是臨床上最常用的抗腫瘤藥物之一，主要對(duì)泌尿生殖系的膀胱、睪丸、卵巢及頭頸部惡性腫瘤有效。但是因?yàn)槠鋰?yán)重的耳毒性和腎臟損害限制了其臨床的應(yīng)用范圍和劑量。研究［4，5］發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布和順鉑通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制腫瘤的增殖，并且兩者之間有協(xié)同作用，塞來(lái)昔布能夠通過(guò)抑制P13K/Akt途徑增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。說(shuō)明順鉑和P13K/Akt途徑具有相關(guān)性，但是順鉑能否通過(guò)P13K/Akt途徑參與耳毒性作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。順鉑與耳蝸組織結(jié)合后可激發(fā)產(chǎn)生大量的自由基，諸如超氧化物、過(guò)氧化氫、毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物等，這些氧自由基的增加可引起耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增高并因此而導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡［6］。順鉑在增加細(xì)胞內(nèi)自由基活動(dòng)的同時(shí)，還可明顯降低耳蝸組織中抗氧化酶類的活性［7］。Akt是絲氨酸—蘇氨酸蛋白酶，與多種細(xì)胞的存活信號(hào)相關(guān)聯(lián)，一旦被激活，Akt可通過(guò)Bad和Caspase-9等底物磷酸化行使抗凋亡效應(yīng)，直接調(diào)節(jié)凋亡機(jī)制，或通過(guò)人端粒酶催化蛋白亞單位、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄家族成員和IB激酶等間接抑制凋亡［8，9］。研究［10］表明，Akt能夠通過(guò)磷酸化其下游的多種作用底物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖;抑制細(xì)胞凋亡;提高細(xì)胞的缺氧耐受;促進(jìn)血管生成;促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移;促進(jìn)對(duì)化療和放療的抵抗。研究［11，12］發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR通路的激活可以阻止順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用，Akt還可以通過(guò)抑制p53的磷酸化和細(xì)胞核功能導(dǎo)致人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥。但是，順鉑作用后豚鼠耳蝸p-Akt表達(dá)是否發(fā)生變化尚不清楚。

圖2 3組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果

圖3 3組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

連翹酯苷作為連翹屬植物中的咖啡酰糖苷類中主要有效成分之一，有很強(qiáng)的抗菌活性，抗菌譜廣，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌均有抑制作用，而且還有較強(qiáng)的抗病毒和調(diào)節(jié)免疫分子的作用［13］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，連翹酯苷有顯著的抗氧化、抗微生物感染和清除自由基、減輕過(guò)氧化損傷的作用。然而，連翹酯苷能否通過(guò)調(diào)節(jié)p-Akt的表達(dá)，從而對(duì)順鉑的耳毒性起防護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑組測(cè)試頻率2、4、6、8 kHz處DPOAE幅值較正常組降低，提示順鉑的耳毒性損傷主要是高頻的聽力損傷;而連翹酯苷組測(cè)試頻率2、4、6、8 kHz處DPOAE幅值較順鉑組升高，說(shuō)明連翹酯苷對(duì)順鉑的耳毒性起到了一定的防護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，順鉑組豚鼠耳蝸p-Akt蛋白水平較正常組及連翹酯苷組降低，提示上調(diào)p-Akt的表達(dá)可能是連翹酯苷對(duì)順鉑的耳毒性防護(hù)作用的機(jī)制之一。

總之，連翹酯苷對(duì)豚鼠耳毒性損傷有防護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)p-Akt表達(dá)有關(guān)。

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