影響SPE-GC/MS法檢測發酵食品中氨基甲酸乙酯因素的研究

夏 強，唐 利，梁 如，鄭 佳，袁華偉，吳重德，黃 鈞，周榮清，2，3，*

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610065；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000；3.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都610065）

氨基甲酸乙酯（EC），又稱為尿烷、烏來坦等，是一種具有潛在致癌性的化合物[1-2]。1987年被國際癌癥研究機構（IARC）歸為2B類致癌物，對其進行重新評估后又將其提升為2A類，即屬于對人類的潛在性致癌物。已有研究表明，在酒精飲料或其他發酵食品生產過程中，精氨酸等組分通過尿素循環途徑產生的尿素與乙醇在高溫，或在Cu2+/Fe3+催化下氰化物轉換為氰酸鹽而生成EC[3-4]。為了揭示不同類型發酵產品中EC含量，已研究開發了多種色譜及光譜檢測技術[5-6]，其中HPLC-FID因其設備投資過高，且方法操作復雜，而FTIR結合偏最小二乘法僅是一種半定量方法，都難以成為通用的方法。氣質聯用技術具有操作簡單、靈敏度高以及重現性良好等特點，1994年被AOAC推薦用于酒精飲料和醬油的標準檢測方法，其后陸續修改了操作方式[7]。基于檢測對象基質性質和組織結構的差異，開發了多種衍生方法，試圖解決EC含量低，樣品雜質對結果干擾大的技術難題。開發的技術包括LLE-GC/MS[8]，SPME-GC/MS[9]，GC-NPD[10]，GC-HECD[11]，GC-MS/MS[12]和基質固相分散技術結合GC/MS[13]等，但這些方法存在耗時長、凈化步驟繁瑣和難以高通量檢測等缺陷。固相萃取（SPE）是液固萃取和液相色譜相結合的新型樣品前處理技術。該技術通過選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品富集、分離和凈化，能降低樣品基質干擾，提高檢測靈敏度。國內一些研究者[14]在實際應用過程中表明SPE-GC/MS方法具有檢測精度、重現性、回收率高的特點。

本文基于影響SPE-GC/MS技術的主要因素，進行了洗脫溶劑用量、pH和不同類型的SPE小柱等關鍵參數的優化研究，并以白酒、糟醅、黃水、豆醬、醬油等不同物性的傳統發酵產品驗證了該技術的可靠性和實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基甲酸乙酯（EC，CAS 51-79-6）、氨基甲酸丙酯（PC，CAS 627-12-3） 購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，色譜純；無水硫酸鈉、氫氧化鈉 分析純；二氯甲烷、無水乙醇、甲醇、己酸 成都高新區蜀都化驗設備廠，色譜純；白酒、醋、甜面醬、醬油、豆瓣、辣椒醬 購自本地超市；糟醅、黃水 取自當地工廠，均為白酒的中間產物；醬醪 實驗室自制。

Trace GC Ultra DSQⅡ氣質聯用儀 美國賽默飛世爾公司（Thermo Fisher），配備HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）毛細管色譜柱，Agilent，美國；ChemElut（100/pk） Agilent公司；Chromclean PSA（乙二胺基-N-丙基）小柱（200mg，3m L）、Chromclean SLE硅藻土小柱（4000mg，12m L）、Forisil SPE柱（3m L，500mg） 成都思維儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作液的配制 分別稱取適量的EC和PC，用甲醇定容到100m L，配制100mg/L的EC和PC貯備液。取一定體積EC貯備液，并加入相同含量的PC，最終EC工作液濃度為500、250、125、60、30μg/L。貯備液與工作液密封后于4℃冰箱貯存備用。

1.2.2 方法的穩定性 分別從黃水、醬油、白酒等樣品提取EC，置于4℃的冰箱中放置1、2、3d，每天測定一次。

1.2.3 樣品預處理方法

1.2.3.1 液體發酵制品的預處理 方法同AOAC 994.07[7]。取3g樣品溶液，加入10μL PC（100μg/m L）作為內標，渦旋混勻。加入到相應的SPE小柱，靜置4m in，20m L萃取溶劑分兩次等體積洗脫。收集洗脫液，用無水硫酸鈉過濾脫水，最后用氮氣濃縮至0.5m L，取1μL進行GC/MS分析。

1.2.3.2 固體發酵制品的預處理 稱取2g樣品，用3m L 20%乙醇溶液浸泡30min，超聲萃取30min，然后再離心10m in（8000r/m in，4℃），收集上清液。后續步驟同1.2.3.1。

1.2.3.3 不同SPE柱的洗脫程序 Chromaclean SLE小柱和ChemElut小柱的預處理方式同1.2.3.1。Florisil柱洗脫程序：先用8m L二氯甲烷活化，然后將加入內標的樣品轉移至SPE小柱中，并用10m L二氯甲烷洗滌，再用15m L 5%甲醇/二氯甲烷洗脫，收集甲醇/二氯甲烷相，用無水硫酸鈉過濾，最后用氮氣濃縮至0.5m L，取1μL進行GC/MS分析。

1.3 GC/MS的分析程序

初始溫度100℃，保持3m in后，以5℃/m in升至120℃，保持0.5m in，然后以3℃/m in升至130℃；再以8℃/m in升至170℃；再以10℃/m in升至220℃，保持10m in。進樣口溫度250℃；載氣流速為1.0m L/m in；載氣為高純氦氣（99.999%）；離子源溫度、連接口溫度分別為230℃和250℃；EI電子能量為70eV；采用選擇離子檢測模式（Selective ion monitoring，SIM），檢測離子為m/z 62，74和89，其中m/z 62作為定量離子。

1.4 數據分析

本實驗的數據分析與制圖采用Origin 8.5，顯著性分析則采用SPSS 19.0進行。所有結果均有三次平行實驗。

2 結果與討論

2.1 EC的定量

本文對EC的定量采用內標法，以PC作為內標物質。如圖1所示，EC和PC標準品對應的保留時間分別為10.35、12.72m in。EC的保留時間偏差為0.02min，所監測的三個離子（m/z 62，74和89）其相對離子豐度分別為100%、25.8%、7.2%，偏差不超過15%，則報道EC為陽性檢出，否則為陰性（圖2）。

圖1 EC和PC的離子流圖Fig.1 Total ion currents of EC and PC

圖2 SIM模式下EC對應的質譜圖Fig.2 Typicalmass spectrometry of EC in SIM mode

以EC的濃度為橫坐標，EC/PC的峰面積之比（SEC/SPC）為縱坐標繪制EC內標校正曲線（圖3），其線性回歸方程為：y=2345.98x-12.18（R2=0.9992），在30～500μg/L檢測范圍線性關系良好。在測定基酒時，以信噪比（S/N）為3和10求得EC檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別為8.6μg/L和28.7μg/L。此定量限略高于同類檢測方法的最低限5μg/L[15]，而又遠優于HPLC-FID[16]中243.9μg/L的定量限，這與儀器的靈敏度及所選方法有關，而此處的LOD和LOQ能滿足一般發酵制品中EC檢測與定量的要求。

圖3 EC校正曲線的線性回歸方程Fig.3 Linear regression equation of internal calibration curve

2.2 基于SPE-GC/MS方法檢測EC的穩定性及精密度

準確吸取1μL 315μg/m L的EC，連續進樣5次檢測出峰面積，其RSD為0.12，呈現較好的重現性。所有樣品的日間穩定性均在10%以下。表1是3個不同時間段EC的峰面積，其RSD等于6.20%，呈現良好的穩定性。

表1 SPE-GC/MS法確定EC含量的穩定性Table1 Stability of determining EC in soy sauce by SPE-GC/MS

2.3 SPE小柱的篩選

SPE柱被廣泛應用于EC的前處理步驟，Florisil小柱與Chem Elut小柱用于EC凈化[17]，可以有效除去樣品的色素、多酚和脂肪等雜質。PSA是一種氨基小柱，可作為正相與反相柱，對極性范圍較廣的多種化合物有良好的選擇性，是我國SN/T 0285-2012行業標準所推薦的凈化材料[13]。

針對基質性質的差異性，比較了Florisil小柱、ChemElut小柱和PSA小柱用于基酒EC檢測的影響，結果如圖4所示。Florisil小柱對EC吸附（圖4A）較弱，所以回收率低（50%以下），且洗脫過程中出現明顯的乳化現象，可能與樣品含有的不同極性的化合物與洗脫劑互不相溶有關。此外該柱存在與低分子量化合物共洗脫的問題[17]。Chem Elut為凈化EC應用較普遍的硅藻土小柱，在本實驗中顯示出了良好的洗脫效果，檢出的EC與PC色譜峰清晰，回收率在85%～98%之間（圖4B）。用PSA小柱萃取樣品，加標EC樣品在其保留時間僅有小峰或未見檢出峰，說明PSA顆粒能有效吸附基質中的有機酸和色素等干擾物，但其相應的SPE柱并不適合EC的測定（圖4C）。

表2 兩種SPE柱測定50%酒精溶液中EC的含量Table2 EC levels in spiked ethanol solutions determined by two different SPE columns

Chromclean SLE和ChemElut兩種型號小柱均系硅藻土材質。在本研究中，比較了兩種型號SPE柱用于處理50%酒精模擬體系中加標EC濃度分別是50、260、500μg/L的回收率和精確度，如表2所示。兩種型號的小柱用于萃取EC，均未影響檢測結果的精度和準確性。但是SLE小柱用于低EC濃度樣品檢測時與加標量有較大誤差，對較高EC濃度樣品的檢測則無此影響。

2.4 SPE條件的優化

2.4.1 二氯甲烷用量對SPE柱洗EC效率的影響 曾有報道[17-18]介紹了乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿等有機溶劑對EC萃取性能的影響，但未報道其用量的影響。二氯甲烷的極性與EC類似，且應用廣泛。本研究比較了不同二氯甲烷用量對SPE柱洗EC效率的影響（圖5）。采用50%乙醇濃度和EC含量為200μg/L的模擬體系，二氯甲烷溶劑從10m L增至15m L，EC回收率增加，說明10m L溶劑并不能將EC完全洗脫。采用20、25、40m L溶劑時，考慮到誤差的影響，回收率變化不大，甚至略有下降，這可能是由于二氯甲烷難以揮發，增加溶劑會延長洗脫劑氮氣濃縮的時間，從而造成EC一定的損失。所以，15m L二氯甲烷是回收率較高而又節省溶劑的最佳洗脫劑用量。

圖5 洗脫溶劑用量對EC回收率的影響Fig.5 Effectof elution solvents volume on EC recovery

2.4.2 pH對EC回收率的影響 pH是影響EC回收率的另一個重要因素[19]，溶液的酸性環境會導致EC解構成其他化合物。有文獻報道在測定酸性樣品時，將調節pH至堿性范圍改善了檢測效果[20]。鑒于檢測體系性質的差異，本文比較了檢測對象pH檢測結果的影響。對于加標了200μg/L EC的50%乙醇（v/v）模擬體系，己酸或1mol/m L NaOH溶液調至不同pH，用15m L二氯甲烷同樣操作條件下經SPE萃取處理后，結果如圖6所示。實驗結果表明，pH為4～5.5，回收率稍有增高，再增至pH為7時回收率顯著增高，隨后將其分別增至8.5和10時，回收率則稍有減少。經SPE萃取、二氯甲烷洗脫偏酸性或堿性的樣品，均使EC的回收率降低，可能是由于偏酸或偏堿的環境導致EC不穩定，在其過程中易降解為其他組分[19]。將pH調至7.0檢測后，其色譜圖的EC峰更對稱。

圖6 pH對EC回收率的影響Fig.6 Effectof pH on EC recovery with ethanol solution

2.5 優化后SPE-GC/MS的應用

表3 固態或半固態發酵制品中EC的含量Table3 EC levels in solid or semisolid fermented foods

表4 液態發酵制品中EC的含量Table4 EC levels in liquid fermented foods

采用優化后的檢測方法，分別檢測了物性不同的9種傳統發酵產品和中間產物的EC含量，結果分別如表3和表4所示。檢測的5種不同類型的半固態樣品（15個樣品），雖然樣品間檢出的濃度差異較大，平行樣品的標準偏差范圍在5.21～0.24μg/kg，而相對標準偏差的范圍是0.34%～4.16%。在檢測的4種不同類型的液態樣品也呈現類似的結果，其中醬油檢測的EC含量與已有文獻報道結果基本一致[21]。黃水、醋和醬油等樣品偏酸性，EC在此介質環境中不穩定，易解構成其他組分[19]，pH調至7.0后不僅改善了檢測結果的準確度，同時檢測的峰形更對稱，佐證了2.4中對應的優化結果。固態樣品因需超聲等預處理，因操作條件的非一致性可能是導致偏差相對較大的原因之一，其RSD均在5%以內，對檢測結果的精度影響不顯著。

3 結論

SPE-GC/MS法是檢測酒精飲料及醬油中EC的標準方法之一，但在測定白酒及其他發酵品和中間產物時，因物性不同及其組分的干擾，妨礙了該技術的應用。本文針對物性及干擾組分的差異，完成了萃取小柱類型、型號、洗脫劑用量及檢測樣品pH等萃取條件優化的研究。研究結果表明，常用的4種不同類型的萃取小柱中，Chromclean SLE小柱的通用性較強，15m L二氯甲烷是最佳的洗脫劑用量，檢測樣品的pH調至7.0后，色譜圖峰有更對稱，改善了檢測的準確度。優化的操作條件經9組（共27個不同來源樣品）不同類型發酵物的驗證，改良的SPE-GCM技術具有線性范圍寬，精度高、重現性好，適用范圍廣的特點，是傳統發酵制品及中間物檢測EC含量的有效手段。

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