紫外分光光度法和高效液相色譜法測定M aillard體系中抗壞血酸含量的比較

唐樂攀，周永妍，余愛農，*

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000；2.湖北民族學院化學與環境工程學院，湖北恩施445000）

Maillard反應是食品加工和儲藏過程中最重要的反應之一[1]，其主要是指羰基化合物與氨基化合物（包括氨基酸、低肽物質、蛋白質等）之間發生的非酶褐變反應。而抗壞血酸（VC）作為另一個在Maillard反應中引起廣泛注意的具有潛在羰基組分的化合物[2]，廣泛存在于各種水果、蔬菜中，而且在食品工業中常用作食品添加劑。因此從食品科學的角度上講，在Maillard體系中測定抗壞血酸的含量，對評價食品品質以及深入了解Maillard反應有著重要的意義。

目前所報道的關于抗壞血酸檢測的方法很多，主要包括碘量法[3]、雜多酸法[4]、熒光法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-8]，其中，碘量法、雜多酸法、熒光法需對樣品進行預處理，滴定終點通常難以確定或操作較繁瑣，易產生誤差。紫外分光光度法操作簡單、準確，但樣品較復雜時易受其他組分紫外吸收的干擾。高效液相色譜法測定精確，但是運行成本較高，測定時間較長。眾所周知，Maillard反應產物極其復雜，且反應后體系為深棕色，反應中間體或產物以及深棕色溶液是否會對VC的檢測產生干擾不得而知。本文擬比較研究紫外分光光度法和高效液相色譜法測定Maillard體系中VC的含量，旨在找到一種適合此體系的VC檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸、偏磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉 均為分析純；甲醇 為色譜純，以上均來自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水 均為雙重蒸餾水。

UV2550紫外-可見光分光光度計日本島津公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；PB-21 pH計、BS-124S電子天平 德國賽多利斯公司；P160001厚壁耐壓瓶 北京欣維爾玻璃儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外分光光度實驗方法

1.2.1.1 標準溶液的配制 用電子天平準確稱取10.0mg抗壞血酸并小心移至100m L棕色容量瓶中，用3%的偏磷酸溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成0.1mg/m L母液備用（現配現用）。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、4.0、5.0、10.0m L母液于10m L容量瓶中，用3%偏磷酸溶液稀釋至刻度，混合均勻。此抗壞血酸標準溶液系列濃度為0、2、4、6、8、10、14、18、22、26、30、34、40、50、100μg/m L。以3%的偏磷酸溶液為參比，在VC最大吸收波長處測定標準系列抗壞血酸溶液的吸光度。

1.2.1.2 檢測波長的選擇 取抗壞血酸標準溶液，在200～400nm波長下測定其吸光度，繪制吸收光譜曲線圖。

1.2.1.3 反應液的制備 據文獻[9]，將0.1761 g（0.001mol）L-抗壞血酸和0.1211g（0.001mol）L-半胱氨酸溶解于10m L 0.2mol/L pH=8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，再用適量NaOH將pH調至8并裝入厚壁耐壓反應瓶中密封。在（140±1）℃下攪拌反應2h后，取出快速冷卻。反應三份作為平行樣。

1.2.1.4 樣品的測定 取25.0μL反應液，用3%的偏磷酸溶液稀釋至50m L搖勻，以3%的偏磷酸溶液作為參比溶液，在VC最大吸收波長處測定樣品的吸光度。

1.2.2 高效液相色譜實驗方法

1.2.2.1 色譜條件 C18色譜柱；二極管陣列檢測器；流動相：由A、B、C三組分組成，A為水，B為甲醇，C為3%的偏磷酸溶液；流速為1.0m L/m in；柱溫30℃；進樣量10μL；梯度洗脫[10]見表1。

表1 梯度洗脫表Table1 Gradientelution program

1.2.2.2 檢測波長的確定 將VC標準溶液進樣并進行全波段掃描，繪制吸收光譜曲線圖。

1.2.2.3 標準溶液的配制 準確稱取100.0mg抗壞血酸并小心移至100m L棕色容量瓶中，用3%的偏磷酸溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成1.0mg/m L母液備用（現配現用）。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L母液，用3%偏磷酸溶液稀釋至10m L，混合均勻。此抗壞血酸標準溶液系列濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/m L。

1.2.2.4 樣品的測定 使用1.2.1.3的方法制備樣品后，取30μL反應液，用3%的偏磷酸溶液稀釋至10m L搖勻后，過0.45μm濾膜，在上述色譜條件和VC最大吸收波長下進行檢測。

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 最大吸收波長的確定 根據繪制吸收光譜曲線圖，得到VC在紫外可見光-分光光度計中最大吸收波長為243nm。

2.1.2 標準曲線的繪制及工作曲線的確定 測定抗壞血酸標準溶液系列的吸光度，結果見表2。

圖1 0～50μg/mL線性曲線Fig.1 Linearity curve of 0～50μg/mL

圖2 0～100μg/mL線性曲線Fig.2 Linearity curve of 0～100μg/mL

表2 VC標準溶液吸光度Table2 Absorbance of VC standard solution

以抗壞血酸濃度C對吸光度A作圖，當濃度最高為50μg/m L時，線性回歸方程為A=0.05547C-0.02042，相關系數R=0.9999，如圖1所示。當濃度增加到100μg/m L時，如圖2所示，線性回歸方程為A=0.04556C +0.15501，相關系數R=0.9893，說明濃度過高，曲線彎曲，導致吸光度與濃度線性關系下降。

表3 紫外分光光度法加標回收率實驗Table3 Spiked Recoveries by UV spectrophotometry

表4 HPLC法加標回收率實驗Table4 Spiked Recoveries by HPLC

但是，根據經驗一般認為紫外分光光度儀測量時吸光度最大不要超過0.8，否則濃度過高容易造成曲線彎曲或者因為儀器本身條件造成誤差。因此我們以0～14μg/m L作為VC標準溶液的工作曲線，同樣以抗壞血酸濃度C對吸光度A作圖，得到線性回歸方程A= 0.05457C-0.01336，相關系數R=0.9998，結果見圖3。

圖3 紫外分光光度法VC工作曲線Fig.3 Working curve of VC standard solution

2.1.3 方法的檢出限 將基線放大，得到最大噪聲值為0.003，以3倍信噪比為定性檢出限，10倍信噪比為定量檢出限，代入線性回歸方程，得到定性檢出限為0.368μg/m L，定量檢出限為0.757μg/m L。

2.1.4 回收率實驗 按照實驗方法，分別對3個平行樣中的抗壞血酸含量進行測定，然后加入同濃度抗壞血酸標準品，再按照上述方法進行回收率實驗。結果顯示，回收率在107%～118%之間，表明紫外分光光度實驗方法檢測VC具有較好的準確性。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 最大吸收波長的確定 根據繪制的吸收光譜曲線圖，結果VC在252nm處有最大吸收波長。

2.2.2 標準曲線的繪制 測定252nm波長下抗壞血酸標準溶液系列的峰面積。以峰面積Y對抗壞血酸濃度C作圖，得到線性回歸方程Y=25916.5C-36.29，相關系數R=0.9998。結果見圖4。

2.2.3 回收率實驗 按照實驗方法，分別對3個平行樣中的抗壞血酸含量進行測定，然后加入同濃度抗壞血酸標準品，再按照上述方法進行回收率實驗。結果顯示，回收率在95.3%～106%之間，表明HPLC檢測VC具有良好的準確性。

圖4 高效液相色譜VC標準曲線Fig.4 Standard curve of VC by HPLC

2.3 反應液的檢測結果

分別使用兩種方法對同樣三個平行樣品進行測定，結果代入標準曲線，在根據不同稀釋程度換算得到原反應液中抗壞血酸濃度，結果分別見表5、表6。

表5 紫外分光光度法測定三個平行樣結果Table5 Determination results of 3 parallel samples by UV spectrophotometry

表6 HPLC法測定三個平行樣結果Table6 Determination results of 3 parallel samples by HPLC

2.4 檢測結果分析

將VC標準溶液和樣品高效液相色譜圖相比較不難發現，樣品色譜圖中只有一個大峰，保留時間為1.195s，與標準溶液中VC的保留時間1.216s在誤差范圍之內，說明樣品在VC最大吸收波長下有紫外吸收的只有VC一種物質，而Maillard反應中間體及產物均沒有吸收，證明了使用紫外分光光度法在VC最大吸收波長下檢測VC含量時，其他干擾較少。

圖5 VC標準溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of VC standard solution

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of sample

究其原因，可能是因為Maillard體系雖然復雜，包含種類繁多的中間體及產物，但是中間體活性很高，很快會繼續參與反應[11]。而產物中風味物質相比于反應底物來講，含量很小，對VC的檢測干擾忽略不計。最終聚合物類黑精，據相關測定反應棕色指數的文獻報道[12-13]，是用反應液在420nm處的吸光值來表征，對于VC的紫外吸收也沒有干擾。

3 結論

比較兩種方法不難發現，雖然HPLC平均回收率更接近100%，方法更精確，線性范圍更廣，但是紫外分光光度法回收率在107%～118%之間，也具有良好的準確性。分別使用兩種方法對3個平行樣進行檢測時，換算得到原反應液中VC的含量相近，表明兩種方法誤差較小。樣品高效液相色譜圖中，其他組分峰面積可忽略不計，說明紫外分光光度法檢測Maillard體系中VC含量時，其他成分干擾可以忽略，且相比之下紫外分光光度法操作更為簡單，快捷，適合Maillard體系中VC的檢測。

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